tecniche istologiche e microscopia

fornisce un'immagine che deriva dall'attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni

Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione Consente di valutare il rilievo degli oggetti Usata per lo studio delle superfici cellulari o strutture pluricellulari immmagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione in osservazione: rimblaza per dare un'immagine tridimensionale data da un amplificatore elettronico del preparato biologico

le cellule prelevate da tessuti non possono sopravvivere a lungo al di fuori della struttura da cui sono state prelevate poiché vanno incontro a progressiva alterazione e degenerazione che si conclude con la decomposizione ed è invece encessario evitare qualunque alterazione della loro organizzazione originaria (fissarla, appunto) la maggior parte dei tessuti sono molli prima del taglio, il tessuto deve essere “fissato” e “indurito” la fissazione è funzionale al sezionamento, perché la consistenza del tessuto appena prelevato ne impedisce il taglio deve essere fatta quanto più velocemente possibile dopo il prelievo in microscopia ottica: alcol etilico, alcol metilico, aldeidi (in particolare formaldeide) in microscopia elettronica: glutaraldeide N.B. queste due aldeidi formano legamenti crociati tra catene proteiche adiacenti immobilizzandole il tempo di permanenza nel liquido di fissazione varia alternativa: tecnica del congelamento veloce; rapidità e maggior rispetto dell'integrità delle singole molecole formazione di cristalli che producono un aumento di volume dell'acqua: più rapido è il congelamento, più piccoli sono i cristalli che si formano e minori sono i danni per questo vi è anche l'immersione di piccoli volumi di materiale biologico in azoto liquido (-196 gradi) con un congelamento pressochè instantaneo

la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto (3-10 micrometri): il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchiature, dette microtomi il tessuto appena prelevato non è adatto al taglio, pertanto viene inserito in un materiale dotato dell'adeguata consistenza microscopio ottico: paraffina N.B. prima è sottoposto a un processo di sostituzione dell'acqua con alcol etilico e successivamente con un solvente della paraffina stessa, come lo xilolo il frammento può ora essere immerso nella paraffina: una volta che paraffina e campione si sono solidifcati, si può procedere tramite microtomo ad ottenere sezioni di 3-10 micrometri di spessore microscopio elettronico TEM: resine sintetiche più rigide, come la resina ipossidica gli elettroni hanno bassa capacità di penetrazione, incompatibile con il potere di risoluzione che si vuole ottenere sezioni molto sottili, di 20-40 nanometri, ottenute con l'ultramicrotomo e usate per la visione al M.E: o talvolta sezioni di pochi micrometri che migliorano la qualità dell'immagine al M.O. microscopio elettronico SEM: dovendo ottenere un'immagine tridimensionale della superficie, il materiale non viene tagliato viene trattato con metalli pesanti vaporizzati per renderlo riflettente agli elettroni

congelamento e criostato

I COLORANTI ISTOLOGICI SONO SOSTANZE COLORANTI CHE SI LEGANO CON MINORE O MAGGIORE SPECIFICITÀ A STRUTTURE BIOLOGICHE I vari componenti dei tessuti hanno la stessa densità ottica • prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato, per aumentare il contrasto • coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica Affinità tintoriali Basofilia componenti acide nucleo DNA, cromatina, citoplasma ribosomi, RER, Acidofilia componenti basiche, citoplasma molecole basiche, proteine citoplasmatiche Coloranti selettivi Ematossilina (colorante basico): ha affinità per molecole acide come DNA, colorando in blu Eosina (colorante acido): ha affinità per molecole basiche come molt eproteine citoplasmatiche, colorandole in rosso/rosa • Giemsa (blu di metilene, eosina e azzurro II) usata per colorare le cellule del sangue metodo tricromico di Mallory: colora le parti elastiche del tessuto connettivo metodo di Masson metodo di Azan orceina: usata per lo studio di cromosomi, colora il t.connettivo evidenziando le fibre elastiche metacromasia: consiste sulle proprietà che hanno certi coloranti basici del gruppo della tiazina (specialmente il blu di toluidina, la tionina, l'azzurro A) di assumere una colorazione diversa dalla tinta delcolorante impiegato (rosso violetto con il blu di toluidina ad esempio) questi coloranti hanno un caratteristico colore blu (ortocromatico) quando sono diluti in soluzione ma quando si legano in grande quantità a un substrato, formando dimeri e polimeri, assorbono la luce a una più bassa lugnhezza d'onda e appaiono di colore rosso (metacromatico) si verifica con sostanze ad alto peso molecolare che presentano molti gruppi anionici liberi come i glicosamminoglicani acidi della sostanza fondamentale dei tessuti connettivi coloranti vitali: assunti dalle cellule viventi permettendo la loro identificazione e lo studio di funzioni particolari; rosso neutro: concentrato elettivamente nei granuli specifici di dei leucociti colorando quelli dei neutrofili in rosa, quelli degli eosinofili in giallo e i granuli basofili in rosso mattone colorazione sopravitale: se il colorante è somministrato a cellule o a tessuti isolati dell'organismo alirazina: incorporata elettivamente nella sostanza fondamentale dell'osso in corso di calcificazione, colorandola in rosso verde Janus: colora i mitocondri in virtù delle loro proprietà ossido-riduttive coloranti colloidali: trypan blu, litio carminio, blu pirrolo, fagocitati dai macrofagi all'interno di vacuoli citoplasmatici (granulopessia), permettendo l'identificazione di queste cellule e lo studio della fagocitosi il blu di metilene colora vitalmente gli assoni delle cellule nervose • Tricromica • PAS: colorazione per i carboidrati, reazione acido periodico- Shiff; trattamento preliminare con acido periodico che ossida i gruppi 1,2-glicol degli zuccheri in gruppi aldeidici e successiva reazione con il reattivo di Schiff (leucofucsina, ottenuta trattando la fucsina basica con acido solforoso); la parafucsina (cloruro di triamino-trifenilmetano) contenuta nella fucsina basica reagisce con l'acido solforoso trasformandosi in un reattivo incolore, l'acido bis-N-aminosolfonico camrinio di Best: evidenziare glicogeno • Oil red O: colorazione per i lipidi TRICHROME DE MASSON: colorazione per proteine, insieme a reazione di Millon (nitromercurico si combina con la tirosina, rosso), reazione al diazonio (forma complessi con tirosina, triptofano e istidina), metodo di Bennet per evidenziare gruppi -SH e metodi per la dimostrazione dell'arginina come Sakaguchi metodi per studiare gli enzimi prevedono l'inclusione di sezioni di tessuto in un substrato specifico per l'enzima da studiare (es. metodo di Gomori-Takamatsu, specifico per la fosfatasi alcalina) BLEU DE TOLUIDINE, blu di metilene, azzurro B, ecc. per acidi nucleici miscela verde di metile-pironina che colora il DNA in verde e l'RNA in rosso reazione di Feulgen per identificare in modo specifico il DNA: idrolisi acida blanda con HCl che scinde il legame purina-zucchero, liberando il gruppo aldeidico del deossiribosio, seguente trattamento con reattivo di Schiff che reagisce con i gruppi aldeidici e colorando di rosso porpora

Non basta osservare le immagini prodotte dal microscopio, occorre infatti intepretarle Le principali difficoltà di intepretazione sono dovute a : - incidenza della sezione (realtà 3D ▶ immagine 2D) - artefatti (difetto, deformazione meccanica al momento dle prelevamento; rottura della sezione istologica, lentezza nella fissazione) - difetti ottici (deformazione immagine ecc.)

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica) Le tecniche che utilizzano anticorpi permettono un’elevata specificità: sfrutta l'elevata capacità degli anticorpi di distinguere minime differente tr auna proteina e un'altra anticorpi policlonali e monoclonali un anticorpo è una molecola capace di riconoscere con elevata specificità e legare con elevata energia un’altra molecola (antigene). Possiamo sfruttare queste proprietà per riconoscere ed evidenziare* una varietà di antigeni. *) legando all’anticorpo un marcatore si usa la microscopia a fluorescenza o microscopia confocale immunocitochimica

immunoistochimica diretta e indiretta

tecnologia del DNA ricombinante inserimento di un frammento di DNA, precedentemente isolato tramite endonucleasi di restrizione, all'interno di vettori chiamati plasmidi, inseriti poi all'interno di una cellula batterica i plasmidi ricombinanti/chimerici contengono così in parte loro genoma e in parte sequenze di DNA esogeno sono inseriti in batteri (trasformazione) e vengono riprodotti un elevato numero di volte per identificare un determinato segmento di DNA si utilizza una sonda molecolare, con una sequenza complementare a quella del filamento il DNA marcato, prima di essere usato come sonda, viene denaturato a 100 geadi per ottenere DNA a catena singola che potrà poi essere reibridato con mRNA citoplasmatico per renderli evidenti, si usa autoradiografia, dove saranno evidenziati con granuli d'argento tecnica del Nothern Blotting:si estre RNA da strutture biologiche per verificare se esse contengono un dato gene; vengono quindi separati gli RNA in base al loro peso molecolare per elettroforesi e poi ibridizzati con cDNA marcato per verifciare che questo evidenzi la banda di RNA con peso molecolare con peso corrispondente a quello dell'RNA investigato

consiste nel mantenere in vita cellule al di fuori dell'organismo da cui sono state prelevate, se incubate in un terreno di coltura adatto , in condizioni ottimali di temperatura e condizioni di ossigeno, di pressione osmotica e di pH ottimali e in assenza di contaminazione (sterilizzazione degli strumenti e dei liquidi) il mezzo di coltura più usato frequentemente nel passato era il coagulo di plasma che con la sua rete di fibrina dava sostegno alle cellule, che forniva anch ela maggior parte di fattori nutritivi e stimoli di crescita ora si usano anche mezzi "sintetici", costituiti da soluzioni tamponate di amminoacidi, basi puriniche e pirimidiniche, vitamine, zuccheri, sali inorganici in varia concentrazione viene spesso utilizzato anche il siero di vitello sono tutti liquidi che contengono fattori di crescita capaci di favorire la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule in coltura ottenere ceppi puri di cellule identiche che derivano, mediante ripetute divisioni, da una comune cellula madre (linee cellulari clonali) tecnica sfruttata per la medicina rigenerativa e la terapia genica