Fs コア概日時計遺伝子 (CC 遺伝子): 食事も腸内細菌の状態も、粘膜擦過傷における概日リズムとコア CC 遺伝子の振幅には影響を与えません。

抗菌ペプチドの転写レベル：rc-SPF マウスでは、特定の ZT、特に Reg3g や Reg3b などの REG3 ファミリーメンバーで転写レベルが大幅に増加しましたが、LYZ1 などの他の ZT では有意な差はありませんでした。

翻訳レベル：（方法：免疫染色）：REG3gの同様の日内変動パターンはrc-SPF群では観察されたが、SPF-hf群では観察されなかったが、LYZ1の免疫染色では発現レベルや振動レベルに明らかな差はなかった。

方法: ウェスタンブロット: 食事依存性および zt (時間) 依存性の REG3γ 振動を発見

RC 給餌マウス 1 ～ 8 のみが ZT 依存性 Reg3g 発現を示しましたが、RC 給餌マウスまたは HF 給餌マウスでは ZT2 と 10 の陰窩発現に差はありませんでした (図 1F)

1. 微生物の状態や食事に関係なく、コア CC 遺伝子ネットワークは安定しています。 2. 絨毛上皮細胞内の宿主 Reg3g 発現の概日リズムは、食事で選択された微生物を含む腸内微生物の存在によって駆動されます。

HF は、ファーミクテス門に属する種の相対存在量を大幅に増加させ、バクテロイデス門を減少させました。 方法: 16SrRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定と微生物生態の定量的分析 (QIIME) を回腸遠位の内容物に対して定期的に実行しました。

Bray-Curtis によるベータ多様性分析により、RC 微生物群集と HF 微生物群集の間の有意な違いが明らかになりました (表 S3)。

16SrRNA遺伝子コピー数はRC給餌マウスとHF給餌マウスで同様の振幅を示したが、HFはRCと比較して位相シフトを誘導した(図2C)。

RC 給餌マウスと HF 給餌マウスの間で OTU の有意な差が観察され (図 2D)、HF では RC と比較してクロストリジウム目数が大幅に増加し、バクテロイデス目数が減少しました (表 S2)。

eJTK によって識別された発振 OTU と非発振 OTU の割合 (円グラフ)、および固有および共有発振 OTU の数 (ベン図)。回腸分類群の 15% は RC の下で振動し、HF によって大幅に減少しました。 RC給餌マウスの管腔内容物には合計81の固有の振動OTUが観察されましたが、HF給餌マウスには14の固有のOTUが存在しました;RCとHFで重複した振動OTUは2つだけでした（表S4）。

HF 条件下では、RC OTU と比較して、属に注釈が付けられた振動は存在せず、全体的な存在量が減少するか、振動が失われました (図 2F)。

1. HF は回腸遠位部の微生物の豊富さを大きく変化させます。 2. HF は、RC に比較的独特な発振グループのグループを選択しました。 3. HF 発振 OTU の全体的な減少にもかかわらず

ピアソン相関分析の結果は、RC および hf 給餌マウスの管腔内容物中の 3 つの OTU のみが Reg3γ の発現と有意に相関していることを示しました。ラクトバチルス OTU と Reg3g の発現の間には正の相関があったのに対し、クロストリジウム科およびペプチドトコッカス科の OTU の発現には負の相関があった (図 2G)。

Reg3g と負の相関がある OTU は RC または HF 給餌マウスでは変動しませんでしたが、その相対存在量は RC と比較してすべての ZT で有意に増加しました (図 2H)。

クロストリジウム科、乳酸桿菌科、胃連鎖球菌の相対存在量は、Reg3g の発現とほぼ同じ正負の相関関係を示しました (図 2I)。

1. 乳酸菌は RC によって強化され、振動を示します。 2. 特定の乳酸菌 OTU は、宿主の毎日の Reg3g 発現と正の相関があります。 3. HF の供給は微生物の振動を減少させ、クロストリジウム科および胃連鎖球菌の全体的な増殖を促進します。これらは両方とも Reg3g の発現と負の相関があります。

ZT10では、HFライセートと比較して、SPFマウスの回腸内腔におけるライセートへの24時間の曝露により、WTマウスのエンテロイド細胞におけるReg3gの発現が誘導された。

方法: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG、乳酸菌科)、嫌気性胃連鎖球菌 (クロストリジア科 P. stomatis)、および口腔胃嫌気性菌 (LGG、口腔胃連鎖球菌科) を条件培地として使用しました。 結果: エンテロイドを LGG 馴化培地に 12 時間曝露すると、Reg3γ の発現が有意に誘導されました (図 3B)。

我々は、LGG単独ではReg3gの発現を誘導するが、P. stomatis単独では誘導しないことを観察した。腸内細菌科への同時曝露は、LGG の存在下でも Reg3g の誘導を阻害しました。これらのデータは、HF によって選択された細菌が、誘導馴化培地への曝露に関係なく、Reg3g の発現に対して阻害効果を有することを示しています。

目的: LGG または P. stomatis が Reg3g の発現に影響を与えるために MyD88 シグナル伝達を必要とするかどうかを検出する (出典) 方法: SPFMyD88/または MyD88/同腹子の腸を、さまざまな細菌馴化培地に曝露しました。 結果: LGG は MyD88/- では Reg3g を有意に誘導しましたが、MyD88-/- では誘導しませんでした。MyD88 の状態に関係なく、P. stomatis ペアでは誘導はありませんでした (図 3D)。 結論: LGG には MyD88 が必要です

目的: LGG 由来または P. stomatis 由来の小分子が Reg3g 発現に異なる影響を与えるかどうかをさらに解明するために、 方法: 馴化培地をサイズ分画しました (図 3E)。 結果: LGG 由来の 3kDa 未満の小分子は Reg3g の発現を誘導するのに十分でしたが、P. stomatis は 30kDa 未満の小分子を含むすべての成分に対して顕著な阻害効果を示しました。 結論: LGG 由来の小分子は Reg3g を誘導するが、P. stomatis 由来の小分子は myd88 依存的に Reg3g 発現を阻害する。

目的と方法: 3kDa lgg 馴化培地画分の熱処理が Reg3g 発現を誘導する能力に影響を与えるかどうかをテストします。 結果: SPF-WT マウスのエンテロイド細胞では、未処理の 3kDa 単離 LGG と比較して、熱処理により Reg3g を誘導する能力が 30% ～ 40% 減少しました (図 3F)。

1. LGG由来の小分子は熱的に不安定です 2. Reg3g を誘導するには株特異的化合物が必要な場合がある

サブトピック

LGG および L. ロイテリによって生成される固有の小分子をさらに特徴づけて区別するために、次に 3 kDa および熱処理馴化培地で LC-MS/MS による質量分析を実行しました (図 3G)。 3kDa ラクトバチルス・ロイテリは、未処理および加熱処理された 3kDa LGG の両方に対して独特の特性を示します

差異および倍率変化 (FC) 分析 (p1) では、3kDa 未処理 LGG と熱処理 LGG の間には 859 個のユニークな小分子の違いがあることが示されました。一方、3kDa LGG と 3kDa L. ロイテリは 149 個の重複を伴​​う 1439 個のユニークな異なる特性を示しました (図 3H)。 ）。

火山プロットでは、未処理の LGG 3kDa と熱処理した LGG (7.51 ～ 6.88) の間で小分子の存在量が減少していることが示されましたが、3kDa LGG は 3kDa の L. ロイテリと比較してより大きな FC (10.69 ～ 9.88) を示しました (図 3I)。 これは、LGG と L. ロイテリの間の小分子プロファイルの違いが、LGG の熱処理後に観察されたものよりも大きいことを示唆しています。

LGG3kDaと比較して、最も高い正および負のfc含有量を有​​する異なる豊富な分子の上位25個を表S5に示します。多くの代謝産物の正体は不明ですが、一部は分岐鎖アミノ酸として同定されました（表S5、青で強調表示）。あ

どの特定の小分子が Reg3g 発現の誘導または抑制を引き起こすのかは現時点では不明ですが、これらのデータは、各細菌の Reg3g 発現プロファイルに大きな違いがあることを示唆しています。

我々の in vitro での発見を解釈するために、我々は RCfed-GF マウスを、Reg3g 発現を誘導する独特の能力を持つ乳酸株と、REg3g の抗菌特性に独特の耐性を持つ株、すなわち LGG および Lactobacillus reuteri を単一結合させました (図 3J)。 。 Reg3g 発現は、ZT10 で採取された LGG モノ関連マウスの回腸粘膜擦傷においてのみ有意に増加しました (予想ピーク発現) が、GF コントロールや L. ロイテリ モノ関連マウスでは増加しませんでした。 LGG モノ関連マウスのみが Reg3g 振動を示しましたが、GF および L. ロイテリ モノ関連マウスでは 3 つのすべての zt において低い一定の発現レベルが観察されました。

補足資料: LGG モノ関連マウスとその GF 対応マウスに、それぞれ RC または HF を与えました。 LGG-HFは、結合後3週間および4週間でLGG-RCと比較して、控えめではあるが有意な体重増加をもたらしました（図S3E）。

食事の組成と特定の細菌は、宿主の代謝結果の変化に対応して、日中の回腸遠位部の Reg3g に直接影響します。

食事や遺伝的背景は CC の全体的および毎日の発現に影響を及ぼさず、コア CC 遺伝子ネットワークと Reg3g 間の独立性をさらに裏付けています (図 S4A; 表 S1)。

ＲＣＲｅｇ３ｇ／マウスでは、Ｒｅｇ３ｇ発現は日に日に顕著に上昇し増加し、ＺＴ１０でピークに達したが、Ｒｅｇ３ｇ／マウスでは転写物は検出されなかった（図４Ａ）。

Reg3g および他の AMP はコア CC から独立しており、Reg3g は Muc2 の発現と律動性に対する食事の影響を媒介すると考えられます。

Reg3g -/- マウスは、Reg3g/同腹子と比較して同様にHF食誘発性肥満の影響を受けやすく、rc給餌マウスと比較して4週間で体重が12%増加した(図4B)。

１．ＲＣ給餌Ｒｅｇ３ｇ／－対照と比較して、ＲＣ給餌Ｒｅｇ３ｇ－／マウスは、著しく悪い耐糖能、より遅いグルコースクリアランス、及び曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を示した。 2. HF の血糖クリアランス速度は、rc 給餌 Reg3g/マウスとの比較に関係なく、減少しました (図 4C)。

補足資料：遺伝子型に関係なく、HFはファーミクテス属の相対存在量を大幅に増加させ、それに対応してバクテロイデス属の存在量が減少し、放線菌の存在量がわずかに変化しました（図S5A）。

ブレイ・カーティス距離を使用したベータ多様性分析により、管腔内容物の遺伝子型に関係なく、HFのコミュニティメンバーシップが変化することが示されました（図5A;表S3）。

コミュニティメンバーシップの有意な差が遺伝子型間で観察されましたが、これはRCを与えられた場合のみであり、食餌依存性の遺伝子型効果（図5B、左パネル）を示し、HFによって除去されました（図5B、右パネル）。

乳酸桿菌科の相対存在量は、RC 給餌 Reg3g/ マウスと比較して hf 給餌 Reg3g/ マウスで減少しましたが、RC 給餌マウスでは、遺伝子型に関係なく、ほぼすべての ZT に存在するペプチドコッカス科およびクロストリジウム属が減少しました (図 5C)。 。

食事は回腸遠位微生物叢を広範囲に改造し、REG3g の中程度の食事依存性の効果をもたらします。

16SrRNA遺伝子のコピー数はグループ間で差がありませんでしたが、概日リズムはrc給餌reg3g-/マウスでのみ明らかでした（図S5D;表S1）。

他のすべての分類群と比較して、振動分類群は管腔内内容物の順序レベルで最も高い多様性を持っていました（図6A、左パネル; 表S6）。 Reg3g/マウスでは、HF により、rc 給餌対照と比較して、振動する乳酸菌とクロストリジウム菌が減少しました。しかし、Reg3g/マウスでは、HFは振動性バクテロイデス目数を減少させる一方で、振動性クロストリジウム目数も増加させました（図6A、左パネル;表S6）。我々は、粘膜の傷が内腔内容物と比較して独特のOTU振動特性を示すことを観察しました（図6A、右パネル;表S6）。遺伝子型に関係なく、RC の振動 OTU は、管腔内内容物と比較して多様性がはるかに低かった（図 6a; 表 S6）。

多くの振動するラクトバチルス OTU は、遺伝子型に関係なく、rc 給餌マウスにおいて相対存在量の増加を示しました (図 6B)。