PCR Digital

PCR DigitalReacción en Cadena de la Polimerasa. Es una prueba de diagnóstico que nos permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno(VHI).Reacción en Cadena de la Polimerasa. Es una prueba de diagnóstico que nos permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno(VHI).El termino PCR lo introdujo,Vogelstein B., para identificar secuencias mutadas específicas en una fracción de una población celular.plataformas digitalesel uso en la detecciòn VIHLos primeros pasos hacia la PCR digital se dieron hace 30 años cuando se aplicó el concepto de dilución limitante y distribución de Poisson para detectar dianas rarasEl principio clave de la PCR digital es la distribución de una muestra entre múltiples particiones. Sin embargo, la generación manual de múltiples particiones consume mucho tiempo y es laboriosa. Las plataformas digitales disponibles actualmente difieren en el número de particiones, el método de generación de particiones o el equipo especializado requerido.PCR combinada con diluciòn limitada para cuantificar los pro virus en Cèlulas infectadas por el VIH.La plataforma mas usada es QX200, en todos los campos de inestigación Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los desafíos con la determinación del umbral y los falsos positivos no se observan exclusivamente con el ddPCR de Bio-Rad, sino que también parecen estar relacionados con otras plataformas digitales.La determinacion del umbral, las gotas generadas se identifican como positivas o negativas en función de un umbral a un cierto nivel de fluorescencia y esta relación se usa para calcular la abundancia del objetivo usando estadísticas de Poisson.Los desarrollos y avances futuros de la tecnología de PCR digital son prometedores para ayudar en la cuantificación y caracterización precisas del reservorio persistente del VIH.Independientemente del método que se utilice para asignar un umbral, las plataformas de PCR digital actualmente disponibles, incluida la QX200, sufren la observación de particiones falsas positivas y, por lo tanto, resultados falsos positivos. Uno de cada tres pocillos de los controles negativos sin molde tenía 2 o 3 gotitas positivas (0,16-0,22 copias / reacción) para el ensayo de ARN del VIH-1 descrito por Kiselinova et al.determinar un umbral correcto es crucial para para una cuantificaciòn confiable. la muestra se divide en múltiples particiones. Después de la amplificación por PCR, las particiones que contienen la diana producen una señal y se les asigna un resultado positivo. La discriminación entre particiones positivas y negativas sigue siendo un desafío y el establecimiento de umbrales puede influir en la cuantificación, especialmente en entornos de objetivos bajos.Recientemente, se publicó un método novedoso, "Umbrella", que no aplica umbrales estrictos, pero aplica un agrupamiento basado en modelos y tiene en cuenta las probabilidades de clasificación específicas de la partición para producir un resultado de cuantificación final.los métodos de agrupamiento fueron desarrollados porStrain et al. y Jones et al. basado en k-vecino-unión más cercano.El método de Strain et al. define la mediana y la varianza de las nubes negativas y positivas para evaluar la probabilidad estadística de que se incluyan valores atípicos en cualquiera de las nubes ( p  <0,1).Jones y col. desarrolló "definetherain" que utiliza muestras de control negativo y positivo para identificar las dos nubes.Dreo et al. propuso un método de determinación de umbral único, ya que las gotas con una intensidad de fluorescencia intermedia pueden contener gotas positivas verdaderas.Estos métodos descritos asumen una distribución normal (binomial) de las nubes negativas y positivas y no tienen en cuenta los cambios en la fluorescencia de la línea de base entre las poblaciones de gotitas de diferentes muestras. AlloSCT es actualmente el único enfoque conocido mediante el cual el reservorio del VIH puede reducirse drásticamente.Dado que solo una pequeña fracción de todas las posibles células diana CD4 positivas portan ADN del VIH, es necesario analizar un gran número de células para poder cuantificar de manera confiable las concentraciones de ADN del VIH.Los investigadores que pretenden informar una concentración de ADN del VIH en un millón de células CD4 deben dividir el ADN diana entre una serie de reacciones, lo que aumenta el riesgo de detectar gotas falsas positivas e influir en el resultado final de la concentración de ADN del VIH.Este efecto es aún mayor cuando se utilizan muestras en las que el ADN del VIH es aún menos abundante, como PBMC, sangre completa, gotas de sangre seca o biopsias de tejidos.Ventajas PCRUna ventaja importante es que la PCR digital produce una cuantificación absoluta directa.Además de la robustez de ddPCR con respecto a la inhibición y la reducción de la eficiencia de amplificación, se observó una mayor precisión y reproducibilidad para ddPCR en comparación con qPCREsto es especialmente crucial en los esfuerzos de curación del VIH donde el objetivo es detectar los efectos potenciales de las intervenciones en el reservorio del VIHAbreviaturasAunque la PCR digital permite la cuantificación precisa del ADN y ARN del VIH en pacientes, no permite a los investigadores obtener información sobre la capacidad de replicación del reservorio.La medición del reservorio de VIH mediante PCR digital se ha utilizado para medir los efectos del inicio temprano del tratamiento, la vacunación terapéutica , el trasplante alogénico de células madre, las interrupciones estructuradas del tratamiento , inmunización mediante anticuerpos ampliamente neutralizantes, agentes de reversión de la latencia (LRA) y otros agentes terapéuticos novedososEn resumen, la PCR digital ha demostrado ser una nueva tecnología valiosa y, con la perspectiva de mejoras adicionales, es probable que se convierta en una herramienta indispensable en la investigación futura del VIH.ARTE:terapia antirretroviralddPCR:gota de PCR digitalqPCR:PCR en tiempo realLRA:agente de reversión de latenciaBibliografíaDigital PCR as a tool to measure HIV persistence. Rutsaert, S., Bosman, K., Trypsteen, W., Nijhuis, M., & Vandekerckhove, L. (2018). Digital PCR as a tool to measure HIV persistence. Retrovirology15(1), 16. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0399-0
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