Galleria mappe mentale Una dieta ricca di grassi interrompe REG3g e i ritmi microbici intestinali e promuove disordini metabolici
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Una dieta ricca di grassi distrugge REG3g e la flora microbica intestinale ritmi che promuovono la disfunzione metabolica
L’espressione quotidiana di SIReg3g è indipendente dalla rete genetica centrale del CC e richiede un microbiota intestinale indotto dalla dieta
Fs Geni centrali dell'orologio circadiano (geni CC): né la dieta né lo stato microbico intestinale influenzano la ritmicità circadiana e l'ampiezza dei geni CC centrali nei raschiati della mucosa
Materiale supplementare
Livelli di trascrizione del peptide antimicrobico: i topi rc-SPF avevano livelli di trascrizione significativamente aumentati in ZT specifici, specialmente nei membri della famiglia REG3, inclusi Reg3g e Reg3b, senza differenze significative in altri, come LYZ1
Materiale supplementare: anche Muc2, associato a Reg3g, era significativamente elevato nei topi rc-SPF a ZT10
Livello di traduzione: (Metodo: immunocolorazione): un modello di variazione diurna simile di REG3g è stato osservato nel gruppo rc-SPF ma non nel gruppo SPF-hf, mentre non vi era alcuna differenza evidente nei livelli di espressione o nei livelli di oscillazione mediante immunocolorazione di LYZ1
Metodi: Western blot: scoperte oscillazioni REG3γ dipendenti dalla dieta e da zt (tempo).
Solo i topi 1-8 alimentati con RC mostravano un'espressione Reg3g dipendente da ZT, mentre non vi era alcuna differenza nell'espressione della cripta di ZT2 e 10 nei topi alimentati con RC o HF (Figura 1F)
Materiale supplementare: Reg3g è espresso sia dalle cellule epiteliali intestinali assorbenti che dalle cellule di Paneth, e i geni marcatori sucrasi-isomaltasi (marcatore epiteliale dei villi) e Lyz1 (marcatore delle cellule di Paneth) sono stati utilizzati per confermare la composizione dei componenti cellulari. Le frazioni 1-8 contengono cellule epiteliali intestinali assorbenti e la frazione 9 contiene cripte (comprese le cellule di Paneth).
1. Indipendentemente dallo stato microbico o dalla dieta, la rete genetica centrale del CC è stabile; 2. I ritmi circadiani dell'espressione Reg3g dell'ospite all'interno delle cellule epiteliali dei villi sono guidati dalla presenza di microbi intestinali, compresi i microbi selezionati dalla dieta
Una dieta ricca di grassi altera l’appartenenza alla comunità microbica ileale e sopprime le oscillazioni diurne dei microrganismi rispetto al cibo normale
L'HF ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa delle specie appartenenti al phylum Firmicutes e ha ridotto il phylum Bacteroidetes. Metodi: Il sequenziamento dell'amplicone del gene 16SrRNA e l'analisi quantitativa dell'ecologia microbica (QIIME) sono stati eseguiti regolarmente sul contenuto dell'ileo distale.
Nessuna differenza è stata rilevata nei phyla meno abbondanti
L'analisi della diversità beta con Bray-Curtis ha rivelato differenze significative tra le comunità microbiche RC e HF (Tabella S3)
Materiale supplementare: anche l'analisi delle coordinate principali [PCoA]) e la distanza di Canberra hanno mostrato differenze significative tra le comunità microbiche RC e HF (Tabella S3)
Sebbene il numero di copie del gene 16SrRNA mostrasse ampiezze simili nei topi alimentati con RC e HF, HF ha indotto uno spostamento di fase rispetto a RC (Fig. 2C).
Materiale supplementare: il numero medio assoluto di copie dei geni 16SrRNA in ZT determinato mediante qPCR non differiva tra RC e HF (Figura S2C)
Sono state osservate differenze significative di OTU tra topi alimentati con RC e HF (Fig. 2D), con HF che aumenta significativamente Clostridiales e diminuisce Bacteroidetes rispetto a RC (Tabella S2).
La percentuale di OTU oscillanti e non oscillanti identificate da eJTK (grafico a torta) e il numero di OTU oscillanti univoche e condivise (diagramma di Venn). Il 15% dei taxa ileali oscillava sotto RC ed era significativamente ridotto da HF. Un totale di 81 OTU oscillatori unici sono stati osservati nel contenuto luminale dei topi alimentati con RC, mentre 14 OTU unici erano presenti nei topi alimentati con HF; solo due OTU oscillatori si sovrapponevano in RC e HF (Tabella S4).
In condizioni HF, le oscillazioni annotate sui generi erano assenti, l'abbondanza complessiva diminuiva o si perdeva l'oscillazione rispetto agli OTU RC (Figura 2F).
Sebbene la percentuale di OTU oscillatori diminuisse nello scompenso cardiaco, alcuni pazienti acquisivano ancora oscillazioni (fig. S2D). Due OTU che mostravano oscillazioni sia sotto RC che HF sono state annotate come specie Ruminococcus e Ostospirillum. La loro abbondanza complessiva era influenzata dalla dieta (Fig. S2E; Tabella S4).
1. L’HF modifica significativamente la ricchezza microbica dell’ileo distale 2. HF ha selezionato un gruppo di gruppi di oscillazione relativamente unici per RC. 3. Nonostante la diminuzione complessiva delle OTU con oscillazione HF
Taxa specifici promossi dalla dieta sono associati a cambiamenti diurni nell'espressione di Reg3γ nel SI distale
I risultati dell'analisi di correlazione di Pearson hanno mostrato che solo 3 OTU nel contenuto luminale dei topi alimentati con RC e hf erano significativamente correlati con l'espressione di Reg3γ. È stata riscontrata una correlazione positiva tra l'espressione di Lactobacillus OTU e Reg3g, mentre l'espressione di OTU delle famiglie Clostridiaceae e Peptidetococcaceae era correlata negativamente (Fig. 2G).
Sebbene gli OTU fossero correlati negativamente con Reg3g non oscillassero nei topi alimentati con RC o HF, la loro abbondanza relativa era significativamente aumentata in tutti gli ZT rispetto a RC (Fig. 2H).
L'abbondanza relativa di Clostridiaceae, Lactobacilliaceae e Gastrostreptococcus ha mostrato quasi le stesse correlazioni positive e negative con l'espressione di Reg3g (Fig. 2I).
Materiale supplementare: solo in RC, le Lactobacilliaceae sono aumentate durante il ciclo di buio medio-tardivo, mentre nelle controparti alimentate con HF, Clostridiaceae e Peptidenococcaceae sono aumentate significativamente in diversi ZT (Figura S2F).
1. Le Lattobacilliaceae sono arricchite da RC e presentano oscillazioni 2. Le OTU specifiche dei batteri lattici sono correlate positivamente con l'espressione giornaliera di Reg3g dell'ospite. 3. L'alimentazione HF riduce l'oscillazione microbica e promuove l'espansione complessiva di Clostridiaceae e Gastrostreptococcus, entrambi negativamente correlati con l'espressione di Reg3g.
Il microbiota intestinale complesso indotto dalla dieta o i singoli ceppi influenzano direttamente l’espressione di Reg3g in vitro
A ZT10, rispetto al lisato HF, l'esposizione al lisato nel lume ileale dei topi SPF per 24 ore ha indotto l'espressione di Reg3g nelle cellule enteroidi dei topi WT.
Metodo: come terreno condizionato sono stati utilizzati Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, famiglia Lactobacilliaceae), Streptococco gastrico anaerobico (clostridiaceae P. stomatis) e anaerobi orogastrici (LGG, famiglia Orogastric Streptococcus). Risultati: L'esposizione degli enteroidi al mezzo condizionato con LGG per 12 ore ha indotto in modo significativo l'espressione di Reg3γ (Figura 3B).
Abbiamo osservato che LGG da solo induceva l'espressione di Reg3g, mentre P. stomatis da solo no. La co-esposizione alle Enterobacteriaceae ha inibito l'induzione di Reg3g anche in presenza di LGG. Questi dati indicano che i batteri selezionati mediante HF hanno un effetto inibitorio sull'espressione di Reg3g indipendentemente dall'esposizione al mezzo condizionato ad induzione.
Scopo: rilevare se LGG o P. stomatis richiedono la segnalazione MyD88 per influenzare l'espressione di Reg3g (fonte) Metodi: Gli intestini di SPFMyD88/o MyD88/littermates sono stati esposti a diversi terreni condizionati batterici. Risultati: LGG ha indotto in modo significativo Reg3g in MyD88/-, ma non in MyD88-/-, non c'è stata induzione nelle coppie di P. stomatis indipendentemente dallo stato di MyD88 (Figura 3D); Conclusione: LGG ha bisogno di MyD88
Scopo: chiarire ulteriormente se le piccole molecole derivate da LGG o P. stomatis influenzano in modo differenziale l'espressione di Reg3g, Metodi: i media condizionati sono stati frazionati per dimensioni (Figura 3E). Risultati: Piccole molecole inferiori a 3 kDa derivate da LGG erano sufficienti per indurre l'espressione di Reg3g, mentre P. stomatis aveva un effetto inibitorio significativo su tutte le frazioni contenenti piccole molecole inferiori a 30 kDa. Conclusione: le piccole molecole derivate da LGG inducono Reg3g, mentre le piccole molecole derivate da P. stomatis inibiscono l'espressione di Reg3g in modo dipendente da myd88.
Scopo e metodi: verificare se il trattamento termico di una frazione media condizionata di 3kDa lgg influisce sulla sua capacità di indurre l'espressione di Reg3g. Risultati: Nelle cellule enteroidi di topi SPF-WT, il trattamento termico ha comportato una riduzione del 30%-40% della capacità di indurre Reg3g rispetto al LGG isolato da 3kDa non trattato (Figura 3F)
1. Le piccole molecole derivate da LGG sono termicamente instabili 2. Potrebbero essere necessari composti ceppo-specifici per indurre Reg3g
I batteri Gram-positivi indotti dalla dieta sono particolarmente resistenti a REG3gd
sottoargomento
Materiale supplementare Scopo: determinare se REG3g presenta effetti battericidi differenziali contro diversi batteri Gram-negativi e Gram-positivi rappresentativi: inclusi Orosporum sp., LGG e Lactobacillus reuteri Risultati: i batteri Gram-negativi erano resistenti a rREG3g. Il declino di L. reuteri è stato simile a quello di P. stomatis, mentre LGG era sensibile solo a basse concentrazioni e resistente ad alte concentrazioni di rREG3g (Fig. S3A). Conclusione: ciò indica che i batteri indotti dalla dieta possono avere una sensibilità unica a REG3γ, rivelando inoltre che solo alcuni lattobacilli possono essere resistenti alle proprietà antibatteriche di REG3g rispetto ad altri batteri Gram-positivi.
Piccole molecole di LGG possono indurre in modo univoco l'espressione di Reg3g, che non è prodotto universalmente da tutti i batteri lattici
riepilogo
3kDa Lactobacillus reuteri ha mostrato una ridotta capacità di indurre l'espressione di Reg3g rispetto a 3kDa LGG (Fig. S3B).
Per caratterizzare e differenziare ulteriormente le piccole molecole uniche prodotte da LGG e L. reuteri, abbiamo successivamente eseguito l'analisi della spettrometria di massa mediante LC-MS/MS a 3 kDa e mezzi condizionati trattati termicamente (Figura 3G) 3kDa Lactobacillus reuteri presenta caratteristiche uniche rispetto al 3kDa LGG sia non trattato che trattato termicamente
L'analisi della differenza e del cambiamento di piega (FC) (p1) ha mostrato: 859 differenze uniche di piccole molecole tra LGG 3kDa non trattato e trattato termicamente mentre LGG 3kDa e L. reuteri hanno mostrato 1439 proprietà diverse uniche, con una sovrapposizione di 149 (Fig. 3H); ).
Il grafico del vulcano ha mostrato una diminuzione dell'abbondanza di piccole molecole tra LGG 3kDa non trattato e LGG trattato termicamente (7,51–6,88), mentre LGG 3kDa ha mostrato una FC maggiore (10,69–9,88) rispetto a L. reuteri 3kDa (Figura 3I). Ciò suggerisce che le differenze nei profili delle piccole molecole tra LGG e L. reuteri sono maggiori di quelle osservate dopo il trattamento termico di LGG.
Le prime 25 molecole differenzialmente abbondanti con il contenuto fc positivo e negativo più elevato rispetto a LGG3kDa sono mostrate nella Tabella S5. Sebbene le identità di molti metaboliti siano sconosciute, alcuni sono stati identificati come aminoacidi a catena ramificata (Tabella S5, evidenziati in blu). UN
Sebbene al momento non sia chiaro quali piccole molecole specifiche guidino l’induzione o la repressione dell’espressione di Reg3g, questi dati suggeriscono che esistono differenze significative nel profilo di espressione di Reg3g di ciascun batterio.
L'espressione di Reg3g nell'ileo distale è specifica del ceppo di lattobacilli ed è influenzata dalla composizione della dieta
Per tradurre i nostri risultati in vitro, abbiamo associato topi RCfed-GF con ceppi di acido lattico che hanno una capacità unica di indurre l'espressione di Reg3g e ceppi che sono unicamente resistenti alle proprietà antimicrobiche di REg3g, vale a dire LGG e Lactobacillus reuteri (Figura 3J) . L'espressione di Reg3g era significativamente aumentata solo nelle abrasioni della mucosa ileale di topi mono-associati a LGG raccolti a ZT10 (picco di espressione previsto), ma non nei controlli GF o nei topi mono-associati a L. reuteri. Solo i topi mono-associati a LGG mostravano oscillazioni Reg3g, mentre livelli di espressione bassi e costanti sono stati osservati nei topi GF e L. reuteri-mono in tutti e 3 i topi mono-associati.
Materiali supplementari: È interessante notare che L. reuteri monoassociato provoca un aumento di peso significativo nei pazienti nell'arco di 4 settimane rispetto a GF e LGG monoassociati, sebbene non vi sia stata alcuna differenza significativa nel peso del cuscinetto adiposo gonadico (Figure S3C e S3D).
Materiali supplementari: topi monoassociati LGG e le loro controparti GF sono stati alimentati rispettivamente con RC o HF. LGG-HF ha comportato un aumento di peso modesto ma significativo rispetto a LGG-RC a 3 e 4 settimane dopo l'associazione (Fig. S3E).
Il grasso gonadico era significativamente aumentato sia nei topi GF-HF che LGGRC rispetto a GF-RC (Fig. S3F).
1. A ZT2 e 10 (espressione più bassa e di picco nei topi SPF alimentati con rc), l'espressione di Reg3g era significativamente aumentata solo nelle abrasioni della mucosa ileale di LGG-RC, mentre non vi era alcun cambiamento nei topi LGG-HF. 2. L'espressione di Lyz1 era aumentata solo nei topi LGGRC (Figure S3G e S3H).
La composizione della dieta e i batteri specifici influenzano direttamente Reg3g nell'ileo distale durante il giorno, corrispondente ai cambiamenti negli esiti metabolici dell'ospite.
Il deficit di REG3g non influisce sull'espressione del gene CC del nucleo dell'intestino tenue e promuove la tolleranza al glucosio dipendente dalla dieta
La dieta o il background genetico non hanno influenzato l'espressione complessiva e quotidiana di CC, supportando ulteriormente l'indipendenza tra la rete genetica CC centrale e Reg3g (Fig. S4A; Tabella S1).
In RCReg3g/topo, l'espressione di Reg3g era significativamente elevata e aumentava di giorno in giorno, raggiungendo un picco a ZT10, mentre in Reg3g/topo non è stata rilevata alcuna trascrizione (Fig. 4A).
Materiali supplementari: la dieta o il genotipo non hanno avuto alcun effetto sui livelli di espressione, sul ritmo circadiano o sull'ampiezza di Crypt4, Lyz1, Ang4 e Tlr (Figure 4A e S4B; Tabella S1).
I topi Reg3g/ alimentati con rc mostrano livelli complessivi e modelli diurni aumentati di espressione di Muc2, con un picco a ZT10 che riflette Reg3g, tuttavia, nei topi Reg3g/ alimentati ad alta frequenza così come nei topi Reg3g-/ alimentati ad alta frequenza, l'espressione di Muc2 era ridotta e cardiaca; sono state osservate aritmie (Fig. S4C).
Reg3g e altri AMP sono indipendenti dal CC centrale e Reg3g sembra mediare gli effetti della dieta sull'espressione e sulla ritmicità di Muc2
I topi Reg3g −/− erano ugualmente suscettibili all'obesità indotta dalla dieta HF rispetto ai topi Reg3g/littermates, mostrando un aumento del 12% del peso corporeo in 4 settimane rispetto ai topi alimentati con RC (Figura 4B).
Materiale supplementare: non sono state riscontrate differenze nel peso del fegato, mentre l'HF ha aumentato significativamente il grasso gonadico e mesenterico indipendentemente dal background genetico (Figura S4D)
1. Rispetto ai controlli Reg3g/- alimentati con RC, i topi Reg3g-/ alimentati con RC hanno mostrato una tolleranza al glucosio significativamente peggiore, una clearance del glucosio più lenta e un'area sotto la curva (AUC) aumentata. 2. Il tasso di clearance del glucosio nel sangue dell'HF è stato ridotto, indipendentemente dal fatto che fosse relativo a Reg3g/topo alimentato con RC (Figura 4C).
REG3g non altera gli esiti dell'obesità indotta dalla dieta con scompenso cardiaco, ma può svolgere un ruolo funzionale nel modo in cui la dieta influisce sulla tolleranza al glucosio.
Una dieta ricca di grassi contrasta i modesti effetti di REG3g sul microbiota ileale e altera specifiche famiglie batteriche associate all’espressione di REg3g
Materiali supplementari: indipendentemente dal genotipo, l'HF ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa di Firmicutes, con una corrispondente diminuzione dell'abbondanza di Bacteroidetes e un leggero cambiamento nell'abbondanza di Actinobacteria (Fig. S5A).
Non sono state riscontrate differenze nell'abbondanza relativa di proteobatteri, cianobatteri e softneurobatteri (dati non mostrati). Ciò era evidente anche con una risoluzione tassonomica più elevata oltre il livello del phylum (Fig. S5B; Tabella S2).
L'analisi della diversità beta utilizzando la distanza di Bray-Curtis ha mostrato che l'appartenenza alla comunità di HF è cambiata indipendentemente dal genotipo del contenuto luminale (Fig. 5A; Tabella S3)
Sono state osservate differenze significative nell'appartenenza alla comunità tra i genotipi, ma solo quando alimentati con RC, indicando un effetto genotipo dipendente dalla dieta (Fig. 5B, pannello di sinistra), che è stato ablato dall'HF (Fig. 5B, pannello di destra).
Materiale supplementare: abbiamo esplorato ulteriormente gli effetti della dieta e di REG3g sui membri della comunità microbica del contenuto luminale a livello familiare. L'HF ha comportato una diminuzione dell'abbondanza relativa di Lactobacilliaceae, mentre un aumento del numero di Peptidococcaceae e Clostridiaceae, indipendentemente dal genotipo (Fig. S5C).
L'abbondanza relativa di Lactobacilliaceae era ridotta nei topi Reg3g/ alimentati con HF rispetto ai topi Reg3g/ alimentati con rc, mentre nei topi alimentati con rc, Peptidococcaceae e Clostridiaceae erano presenti in quasi tutti gli ZT erano ridotti indipendentemente dal genotipo (Fig. 5C). .
La dieta rimodella ampiamente il microbioma ileale distale, con effetti moderati e dipendenti dalla dieta di REG3g.
La mancanza di legame tra Reg3g e HF favorisce una maggiore oscillazione dei Clostridi e dei batteri sensibili all'effetto battericida di Reg3g
Sebbene il numero di copie del gene 16SrRNA non differisse tra i gruppi, la ritmicità circadiana era evidente solo nei topi reg3g-/ alimentati con rc (Fig. S5D; Tabella S1).
Il rilevamento del sequenziamento dell'amplicone del gene 16SrRNA del contenuto intraluminale da parte di eJTK ha rivelato differenze dipendenti dalla dieta nelle oscillazioni di taxa specifici tra diversi genotipi (Fig. S5B; Tabella S4).
Abbiamo osservato che i topi Reg3g/alimentati con RC mostravano OTU più oscillatori rispetto ai topi alimentati con hf, mentre entrambi i gruppi Reg3g/dieta mostravano quasi lo stesso numero (Fig. S5E, pannello di sinistra; Tabella S4). Il raschiamento della mucosa ha mostrato lo schema opposto, con Reg3g/topi che mostravano più OTU oscillatori indipendentemente dalla dieta (Fig. S5E, pannello di destra).
Rispetto a tutti gli altri taxa, i taxa oscillatori avevano la più alta diversità a livello ordinale dei contenuti intraluminali (Fig. 6A, pannello di sinistra; Tabella S6). Nei topi Reg3g, l'HF ha comportato una riduzione dei lattobacilli e dei clostridi oscillanti rispetto ai controlli alimentati con RC. Tuttavia, in Reg3g/mouse, HF ha ridotto gli ordini oscillatori di Bacteroidetes aumentando allo stesso tempo gli ordini oscillatori di Clostridiales (Fig. 6A, pannello di sinistra; Tabella S6). Abbiamo osservato che i graffi della mucosa mostravano proprietà oscillatorie OTU uniche rispetto al contenuto luminale (Fig. 6A, pannello di destra; Tabella S6). Indipendentemente dal genotipo, gli OTU oscillatori di RC erano molto meno diversificati rispetto al loro contenuto intraluminale (Fig. 6a; Tabella S6).
Reg3g/topi hanno anche mostrato il numero più elevato di batterioideti oscillanti e clostridi rispetto a Reg3g/topi, indipendentemente dalla dieta.
Molte OTU oscillanti di Lactobacillus hanno mostrato una maggiore abbondanza relativa nei topi alimentati con RC indipendentemente dal genotipo (Figura 6B).
esente da agenti patogeni specifici (SPF) sterile senza germi (GF) Punti temporali Zeitgeber (ZT) Proteina gamma rigenerante derivata dalle isole (Reg3g) un orologio circadiano centrale (CC) dieta ricca di grassi (HF). dieta regolare (RC). peptide antimicrobico (AMP) unità tassonomiche operative (O TU)