Fs Geni centrali dell'orologio circadiano (geni CC): né la dieta né lo stato microbico intestinale influenzano la ritmicità circadiana e l'ampiezza dei geni CC centrali nei raschiati della mucosa

Livelli di trascrizione del peptide antimicrobico: i topi rc-SPF avevano livelli di trascrizione significativamente aumentati in ZT specifici, specialmente nei membri della famiglia REG3, inclusi Reg3g e Reg3b, senza differenze significative in altri, come LYZ1

Livello di traduzione: (Metodo: immunocolorazione): un modello di variazione diurna simile di REG3g è stato osservato nel gruppo rc-SPF ma non nel gruppo SPF-hf, mentre non vi era alcuna differenza evidente nei livelli di espressione o nei livelli di oscillazione mediante immunocolorazione di LYZ1

Metodi: Western blot: scoperte oscillazioni REG3γ dipendenti dalla dieta e da zt (tempo).

Solo i topi 1-8 alimentati con RC mostravano un'espressione Reg3g dipendente da ZT, mentre non vi era alcuna differenza nell'espressione della cripta di ZT2 e 10 nei topi alimentati con RC o HF (Figura 1F)

1. Indipendentemente dallo stato microbico o dalla dieta, la rete genetica centrale del CC è stabile; 2. I ritmi circadiani dell'espressione Reg3g dell'ospite all'interno delle cellule epiteliali dei villi sono guidati dalla presenza di microbi intestinali, compresi i microbi selezionati dalla dieta

L'HF ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa delle specie appartenenti al phylum Firmicutes e ha ridotto il phylum Bacteroidetes. Metodi: Il sequenziamento dell'amplicone del gene 16SrRNA e l'analisi quantitativa dell'ecologia microbica (QIIME) sono stati eseguiti regolarmente sul contenuto dell'ileo distale.

L'analisi della diversità beta con Bray-Curtis ha rivelato differenze significative tra le comunità microbiche RC e HF (Tabella S3)

Sebbene il numero di copie del gene 16SrRNA mostrasse ampiezze simili nei topi alimentati con RC e HF, HF ha indotto uno spostamento di fase rispetto a RC (Fig. 2C).

Sono state osservate differenze significative di OTU tra topi alimentati con RC e HF (Fig. 2D), con HF che aumenta significativamente Clostridiales e diminuisce Bacteroidetes rispetto a RC (Tabella S2).

La percentuale di OTU oscillanti e non oscillanti identificate da eJTK (grafico a torta) e il numero di OTU oscillanti univoche e condivise (diagramma di Venn). Il 15% dei taxa ileali oscillava sotto RC ed era significativamente ridotto da HF. Un totale di 81 OTU oscillatori unici sono stati osservati nel contenuto luminale dei topi alimentati con RC, mentre 14 OTU unici erano presenti nei topi alimentati con HF; solo due OTU oscillatori si sovrapponevano in RC e HF (Tabella S4).

In condizioni HF, le oscillazioni annotate sui generi erano assenti, l'abbondanza complessiva diminuiva o si perdeva l'oscillazione rispetto agli OTU RC (Figura 2F).

1. L’HF modifica significativamente la ricchezza microbica dell’ileo distale 2. HF ha selezionato un gruppo di gruppi di oscillazione relativamente unici per RC. 3. Nonostante la diminuzione complessiva delle OTU con oscillazione HF

I risultati dell'analisi di correlazione di Pearson hanno mostrato che solo 3 OTU nel contenuto luminale dei topi alimentati con RC e hf erano significativamente correlati con l'espressione di Reg3γ. È stata riscontrata una correlazione positiva tra l'espressione di Lactobacillus OTU e Reg3g, mentre l'espressione di OTU delle famiglie Clostridiaceae e Peptidetococcaceae era correlata negativamente (Fig. 2G).

Sebbene gli OTU fossero correlati negativamente con Reg3g non oscillassero nei topi alimentati con RC o HF, la loro abbondanza relativa era significativamente aumentata in tutti gli ZT rispetto a RC (Fig. 2H).

L'abbondanza relativa di Clostridiaceae, Lactobacilliaceae e Gastrostreptococcus ha mostrato quasi le stesse correlazioni positive e negative con l'espressione di Reg3g (Fig. 2I).

1. Le Lattobacilliaceae sono arricchite da RC e presentano oscillazioni 2. Le OTU specifiche dei batteri lattici sono correlate positivamente con l'espressione giornaliera di Reg3g dell'ospite. 3. L'alimentazione HF riduce l'oscillazione microbica e promuove l'espansione complessiva di Clostridiaceae e Gastrostreptococcus, entrambi negativamente correlati con l'espressione di Reg3g.

A ZT10, rispetto al lisato HF, l'esposizione al lisato nel lume ileale dei topi SPF per 24 ore ha indotto l'espressione di Reg3g nelle cellule enteroidi dei topi WT.

Metodo: come terreno condizionato sono stati utilizzati Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, famiglia Lactobacilliaceae), Streptococco gastrico anaerobico (clostridiaceae P. stomatis) e anaerobi orogastrici (LGG, famiglia Orogastric Streptococcus). Risultati: L'esposizione degli enteroidi al mezzo condizionato con LGG per 12 ore ha indotto in modo significativo l'espressione di Reg3γ (Figura 3B).

Abbiamo osservato che LGG da solo induceva l'espressione di Reg3g, mentre P. stomatis da solo no. La co-esposizione alle Enterobacteriaceae ha inibito l'induzione di Reg3g anche in presenza di LGG. Questi dati indicano che i batteri selezionati mediante HF hanno un effetto inibitorio sull'espressione di Reg3g indipendentemente dall'esposizione al mezzo condizionato ad induzione.

Scopo: rilevare se LGG o P. stomatis richiedono la segnalazione MyD88 per influenzare l'espressione di Reg3g (fonte) Metodi: Gli intestini di SPFMyD88/o MyD88/littermates sono stati esposti a diversi terreni condizionati batterici. Risultati: LGG ha indotto in modo significativo Reg3g in MyD88/-, ma non in MyD88-/-, non c'è stata induzione nelle coppie di P. stomatis indipendentemente dallo stato di MyD88 (Figura 3D); Conclusione: LGG ha bisogno di MyD88

Scopo: chiarire ulteriormente se le piccole molecole derivate da LGG o P. stomatis influenzano in modo differenziale l'espressione di Reg3g, Metodi: i media condizionati sono stati frazionati per dimensioni (Figura 3E). Risultati: Piccole molecole inferiori a 3 kDa derivate da LGG erano sufficienti per indurre l'espressione di Reg3g, mentre P. stomatis aveva un effetto inibitorio significativo su tutte le frazioni contenenti piccole molecole inferiori a 30 kDa. Conclusione: le piccole molecole derivate da LGG inducono Reg3g, mentre le piccole molecole derivate da P. stomatis inibiscono l'espressione di Reg3g in modo dipendente da myd88.

Scopo e metodi: verificare se il trattamento termico di una frazione media condizionata di 3kDa lgg influisce sulla sua capacità di indurre l'espressione di Reg3g. Risultati: Nelle cellule enteroidi di topi SPF-WT, il trattamento termico ha comportato una riduzione del 30%-40% della capacità di indurre Reg3g rispetto al LGG isolato da 3kDa non trattato (Figura 3F)

1. Le piccole molecole derivate da LGG sono termicamente instabili 2. Potrebbero essere necessari composti ceppo-specifici per indurre Reg3g

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Per caratterizzare e differenziare ulteriormente le piccole molecole uniche prodotte da LGG e L. reuteri, abbiamo successivamente eseguito l'analisi della spettrometria di massa mediante LC-MS/MS a 3 kDa e mezzi condizionati trattati termicamente (Figura 3G) 3kDa Lactobacillus reuteri presenta caratteristiche uniche rispetto al 3kDa LGG sia non trattato che trattato termicamente

L'analisi della differenza e del cambiamento di piega (FC) (p1) ha mostrato: 859 differenze uniche di piccole molecole tra LGG 3kDa non trattato e trattato termicamente mentre LGG 3kDa e L. reuteri hanno mostrato 1439 proprietà diverse uniche, con una sovrapposizione di 149 (Fig. 3H); ).

Il grafico del vulcano ha mostrato una diminuzione dell'abbondanza di piccole molecole tra LGG 3kDa non trattato e LGG trattato termicamente (7,51–6,88), mentre LGG 3kDa ha mostrato una FC maggiore (10,69–9,88) rispetto a L. reuteri 3kDa (Figura 3I). Ciò suggerisce che le differenze nei profili delle piccole molecole tra LGG e L. reuteri sono maggiori di quelle osservate dopo il trattamento termico di LGG.

Le prime 25 molecole differenzialmente abbondanti con il contenuto fc positivo e negativo più elevato rispetto a LGG3kDa sono mostrate nella Tabella S5. Sebbene le identità di molti metaboliti siano sconosciute, alcuni sono stati identificati come aminoacidi a catena ramificata (Tabella S5, evidenziati in blu). UN

Sebbene al momento non sia chiaro quali piccole molecole specifiche guidino l’induzione o la repressione dell’espressione di Reg3g, questi dati suggeriscono che esistono differenze significative nel profilo di espressione di Reg3g di ciascun batterio.

Per tradurre i nostri risultati in vitro, abbiamo associato topi RCfed-GF con ceppi di acido lattico che hanno una capacità unica di indurre l'espressione di Reg3g e ceppi che sono unicamente resistenti alle proprietà antimicrobiche di REg3g, vale a dire LGG e Lactobacillus reuteri (Figura 3J) . L'espressione di Reg3g era significativamente aumentata solo nelle abrasioni della mucosa ileale di topi mono-associati a LGG raccolti a ZT10 (picco di espressione previsto), ma non nei controlli GF o nei topi mono-associati a L. reuteri. Solo i topi mono-associati a LGG mostravano oscillazioni Reg3g, mentre livelli di espressione bassi e costanti sono stati osservati nei topi GF e L. reuteri-mono in tutti e 3 i topi mono-associati.

Materiali supplementari: topi monoassociati LGG e le loro controparti GF sono stati alimentati rispettivamente con RC o HF. LGG-HF ha comportato un aumento di peso modesto ma significativo rispetto a LGG-RC a 3 e 4 settimane dopo l'associazione (Fig. S3E).

La composizione della dieta e i batteri specifici influenzano direttamente Reg3g nell'ileo distale durante il giorno, corrispondente ai cambiamenti negli esiti metabolici dell'ospite.

La dieta o il background genetico non hanno influenzato l'espressione complessiva e quotidiana di CC, supportando ulteriormente l'indipendenza tra la rete genetica CC centrale e Reg3g (Fig. S4A; Tabella S1).

In RCReg3g/topo, l'espressione di Reg3g era significativamente elevata e aumentava di giorno in giorno, raggiungendo un picco a ZT10, mentre in Reg3g/topo non è stata rilevata alcuna trascrizione (Fig. 4A).

Reg3g e altri AMP sono indipendenti dal CC centrale e Reg3g sembra mediare gli effetti della dieta sull'espressione e sulla ritmicità di Muc2

I topi Reg3g −/− erano ugualmente suscettibili all'obesità indotta dalla dieta HF rispetto ai topi Reg3g/littermates, mostrando un aumento del 12% del peso corporeo in 4 settimane rispetto ai topi alimentati con RC (Figura 4B).

1. Rispetto ai controlli Reg3g/- alimentati con RC, i topi Reg3g-/ alimentati con RC hanno mostrato una tolleranza al glucosio significativamente peggiore, una clearance del glucosio più lenta e un'area sotto la curva (AUC) aumentata. 2. Il tasso di clearance del glucosio nel sangue dell'HF è stato ridotto, indipendentemente dal fatto che fosse relativo a Reg3g/topo alimentato con RC (Figura 4C).

Materiali supplementari: indipendentemente dal genotipo, l'HF ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa di Firmicutes, con una corrispondente diminuzione dell'abbondanza di Bacteroidetes e un leggero cambiamento nell'abbondanza di Actinobacteria (Fig. S5A).

L'analisi della diversità beta utilizzando la distanza di Bray-Curtis ha mostrato che l'appartenenza alla comunità di HF è cambiata indipendentemente dal genotipo del contenuto luminale (Fig. 5A; Tabella S3)

Sono state osservate differenze significative nell'appartenenza alla comunità tra i genotipi, ma solo quando alimentati con RC, indicando un effetto genotipo dipendente dalla dieta (Fig. 5B, pannello di sinistra), che è stato ablato dall'HF (Fig. 5B, pannello di destra).

L'abbondanza relativa di Lactobacilliaceae era ridotta nei topi Reg3g/ alimentati con HF rispetto ai topi Reg3g/ alimentati con rc, mentre nei topi alimentati con rc, Peptidococcaceae e Clostridiaceae erano presenti in quasi tutti gli ZT erano ridotti indipendentemente dal genotipo (Fig. 5C). .

La dieta rimodella ampiamente il microbioma ileale distale, con effetti moderati e dipendenti dalla dieta di REG3g.

Sebbene il numero di copie del gene 16SrRNA non differisse tra i gruppi, la ritmicità circadiana era evidente solo nei topi reg3g-/ alimentati con rc (Fig. S5D; Tabella S1).

Rispetto a tutti gli altri taxa, i taxa oscillatori avevano la più alta diversità a livello ordinale dei contenuti intraluminali (Fig. 6A, pannello di sinistra; Tabella S6). Nei topi Reg3g, l'HF ha comportato una riduzione dei lattobacilli e dei clostridi oscillanti rispetto ai controlli alimentati con RC. Tuttavia, in Reg3g/mouse, HF ha ridotto gli ordini oscillatori di Bacteroidetes aumentando allo stesso tempo gli ordini oscillatori di Clostridiales (Fig. 6A, pannello di sinistra; Tabella S6). Abbiamo osservato che i graffi della mucosa mostravano proprietà oscillatorie OTU uniche rispetto al contenuto luminale (Fig. 6A, pannello di destra; Tabella S6). Indipendentemente dal genotipo, gli OTU oscillatori di RC erano molto meno diversificati rispetto al loro contenuto intraluminale (Fig. 6a; Tabella S6).

Molte OTU oscillanti di Lactobacillus hanno mostrato una maggiore abbondanza relativa nei topi alimentati con RC indipendentemente dal genotipo (Figura 6B).