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Mindmap-Galerie Gentechnik
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Gentechnik
Dies ist eine Mindmap zum Thema Gentechnik, mit einer detaillierten Einführung und einer umfassenden Beschreibung. Ich hoffe, dass sie für interessierte Freunde hilfreich sein kann.
Bearbeitet um 2023-11-24 01:34:49
- Hundert Jahre Einsamkeit Charakter-Beziehungsdiagramm
Einhundert Jahre Einsamkeit ist das Meisterwerk von Gabriel Garcia Marquez. Die Lektüre dieses Buches beginnt mit der Klärung der Beziehungen zwischen den Figuren. Im Mittelpunkt steht die Familie Buendía, deren Wohlstand und Niedergang, interne Beziehungen und politische Kämpfe, Selbstvermischung und Wiedergeburt im Laufe von hundert Jahren erzählt werden.
- Hundert Jahre Einsamkeit Charakter-Beziehungsdiagramm
Einhundert Jahre Einsamkeit ist das Meisterwerk von Gabriel Garcia Marquez. Die Lektüre dieses Buches beginnt mit der Klärung der Beziehungen zwischen den Figuren. Im Mittelpunkt steht die Familie Buendía, deren Wohlstand und Niedergang, interne Beziehungen und politische Kämpfe, Selbstvermischung und Wiedergeburt im Laufe von hundert Jahren erzählt werden.
- Projektmanagement-Prozess-Vorlage
Projektmanagement ist der Prozess der Anwendung von Fachwissen, Fähigkeiten, Werkzeugen und Methoden auf die Projektaktivitäten, so dass das Projekt die festgelegten Anforderungen und Erwartungen im Rahmen der begrenzten Ressourcen erreichen oder übertreffen kann. Dieses Diagramm bietet einen umfassenden Überblick über die 8 Komponenten des Projektmanagementprozesses und kann als generische Vorlage verwendet werden.
Gentechnik
- Hundert Jahre Einsamkeit Charakter-Beziehungsdiagramm
Einhundert Jahre Einsamkeit ist das Meisterwerk von Gabriel Garcia Marquez. Die Lektüre dieses Buches beginnt mit der Klärung der Beziehungen zwischen den Figuren. Im Mittelpunkt steht die Familie Buendía, deren Wohlstand und Niedergang, interne Beziehungen und politische Kämpfe, Selbstvermischung und Wiedergeburt im Laufe von hundert Jahren erzählt werden.
- Hundert Jahre Einsamkeit Charakter-Beziehungsdiagramm
Einhundert Jahre Einsamkeit ist das Meisterwerk von Gabriel Garcia Marquez. Die Lektüre dieses Buches beginnt mit der Klärung der Beziehungen zwischen den Figuren. Im Mittelpunkt steht die Familie Buendía, deren Wohlstand und Niedergang, interne Beziehungen und politische Kämpfe, Selbstvermischung und Wiedergeburt im Laufe von hundert Jahren erzählt werden.
- Projektmanagement-Prozess-Vorlage
Projektmanagement ist der Prozess der Anwendung von Fachwissen, Fähigkeiten, Werkzeugen und Methoden auf die Projektaktivitäten, so dass das Projekt die festgelegten Anforderungen und Erwartungen im Rahmen der begrenzten Ressourcen erreichen oder übertreffen kann. Dieses Diagramm bietet einen umfassenden Überblick über die 8 Komponenten des Projektmanagementprozesses und kann als generische Vorlage verwendet werden.
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- Gliederung
Gentechnik
Gen
Konzept
Eine spezifische Nukleotidsequenz, die eine genetische Wirkung auf das DNA-Molekül hat
Leiten Sie die Synthese wichtiger Substanzen wie Proteine im menschlichen Körper und erhalten Sie die normalen physiologischen Funktionen des menschlichen Körpers aufrecht.
Materielle Ebene: eine Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz auf einem Chromosom.
Funktionelle Ebene: Träger genetischer Informationen, Kodierung der molekularen Funktionen von Proteinen und Ribonukleinsäure (RNA) und Regulierung der Genexpression.
Nukleinsäure
Einstufung
DNA (DNA)
Kern, Mitochondrien, Chloroplasten, Plasmide...
Träger genetischer Informationen
RNA (RNA)
Zytoplasma, Zellkern
Einstufung
Ribosomale RNA (rRNA)
Bestandteile von Ribosomen
Transfer-RNA (tRNA)
Aminosäuren transportieren
Messenger-RNA (mRNA)
Übertragen Sie genetische Informationen aus der DNA und steuern Sie die Proteinsynthese
chemische Komponenten
Elementzusammensetzung: C, H, O, N, P
Molekulare Zusammensetzung:
Base
Purinbasis
Pyrimidinbase
Die Innenseite der Spirale
Pentose
Ribose (U)
Desoxyribose (T)
Phosphorsäure
Das Skelett der Spiralkette
Grundeinheit: Nukleotid
Eine kurze Geschichte
Mendel: Das Erbsenexperiment
Entdecken Sie die Gesetze der Vererbung: Dasselbe Faktorpaar wird getrennt und die verschiedenen Faktorpaare werden frei kombiniert
Zum ersten Mal vorgeschlagen „genetische Faktoren“ (d. h. Gene)
Morgan: Drosophila-Experimente
Gene auf Chromosomen
Vererbte genetische Ketten und Tauschgesetz
Watson & Crick: DNA-Doppelhelix-Strukturmodell
Rechtsdrehende DNA-Doppelhelixstruktur
DNA-Replikationsmechanismus: semikonservative Replikation
Gentechnik
Die Grundlage der Geburt
Drei große theoretische Entdeckungen
Der Träger der genetischen Information ist DNA, nicht Protein [Pneumococcus pneumoniae-Transformationsexperiment]
Doppelhelix-Strukturmodell des DNA-Moleküls und semikonservativer Replikationsmechanismus
Zentrale Dogma- und Operatortheorie und Entschlüsselung des genetischen Codes
Theoretische Basis
Die Grundstruktur der DNA ist in allen Organismen gleich. Verschiedene Gene haben die gleiche materielle Basis, sodass Gene neu kombiniert und ausgetauscht werden können.
Gene können geschnitten und übertragen werden, wodurch sichergestellt wird, dass die Gentechnik auf Gene einwirken kann, ohne deren Funktionen zu beeinträchtigen.
Der genetische Code ist universell und es besteht unabhängig von der Art eine Entsprechung zwischen Polypeptiden und Genen.
Gene können genetische Informationen durch Replikation an die nächste Generation weitergeben.
Drei große Erfindungen der Technik
In-vitro-Technologie zum Schneiden und Verbinden von DNA-Molekülen
Einsatz gentechnischer Vektoren
Xu Lei-Analyse von DNA-Molekülen, Agar-Gel-Elektrophorese, Hybridisierungstechnologie ...
1937: Das erste Jahr der Gentechnik
Konzept
Es bezieht sich auf die Verwendung enzymatischer Methoden zur Rekombination heterologer Gene und Träger-DNA in vitro. Die resultierende rekombinante DNA wird in Wirtszellen eingeführt, sodass die heterologen Gene in den Wirtszellen repliziert und exprimiert werden können, wodurch die Transformation des Empfängers erreicht wird biologische Arten oder Merkmale und Massenproduktion biologischer Sorten und Produkte, die der Mensch braucht,
Auch bekannt als: molekulares Klonen oder rekombinante DNA-Technologie.
Hauptinhalt
Aus dem Genom eines biologischen Organismus wird das DNA-Fragment isoliert, das das gewünschte Gen enthält.
Das exogene DNA-Fragment, das das Zielgen trägt, wird mit einem selbstreplizierenden Vektormolekül mit einer Selektionsmarkierung verbunden, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu bilden.
Die rekombinanten DNA-Moleküle werden auf entsprechende Empfängerzellen (Wirtszellen) übertragen und mit diesen vermehrt.
Aus einer großen Anzahl von Zellvermehrungspopulationen werden die Empfängerzellen, die die rekombinanten DNA-Moleküle erhalten haben, sowie die amplifizierten Zielgene herausgesucht.
Das Zielgen wird in einen Expressionsvektor kloniert und in Wirtszellen eingeführt, damit es unter einem neuen genetischen Hintergrund eine funktionelle Expression erreichen und für den Menschen benötigte Substanzen produzieren kann.
grundlegender Prozess
Fünf grundlegende Arbeitseinheiten: Schneiden, Verbinden, Übertragen, Hinzufügen und Prüfen
Isolieren Sie DNA, die das Gen von Interesse enthält
Restriktionsenzyme schneiden DNA-Fragmente (Cut)
Plasmid wird aus E. coli isoliert und verdaut (verdaut)
Ligase verbindet das Zielgen und das Plasmid für die Enzymverdauung (verbunden mit: DNA-Rekombination)
Schneiden und Spleißen: In-vitro-Rekombination von DNA
Das rekombinante Plasmid in die Wirtszelle einführen (transformieren)
Klonen Sie das Zielgen und testen Sie es auf Expression (Amplifikation und Nachweis).
Test: Screening und Identifizierung von Transformanten
Transformation und Amplifikation: Transformation und Amplifikation rekombinanter DNA-Moleküle
Gene eines beliebigen Organismus → jeder anderen Rezeptorzelle, die nichts damit zu tun hat
Ein bestimmter DNA-Abschnitt → wird in der Empfängerzelle repliziert → stellt eine große Anzahl gereinigter DNA-Fragmente her
Vier Elemente
Werkzeugenzym
Zielgen (Präparation)
Genvektor
Genrezeptor
DNA
Einstufung
chromosomale DNA
Erhalten Sie das Zielgen
Plasmid-DNA
Träger
Virus, Phagen-DNA
Konstruieren Sie Klonierungsvektoren, isolieren Sie Zielgene und regulatorische Faktoren der Genexpression
mitochondriale Chloroplasten-DNA
Erhalten Sie das Zielgen
Extrakt
Vorbereitung biologischer Materialien
Reichhaltiger DNA-Gehalt mit wenigen Verunreinigungen
Plasmid-DNA
Bakterielle Flüssigkultur → späte logarithmische Wachstumsphase
Pflanzen-DNA
Junge Teile oder Sämlinge reduzieren die Ansammlung von Stärke/Zucker → beeinträchtigen die DNA-Extraktion
tierische DNA
Bereiche mit hoher Enzymaktivität entfernen
lysierte Zellen
Richtige Lyse zur Vermeidung von DNA-Strangbrüchen
Prokaryoten: Lysozym, Ultraschall, NaOH, SDS-Behandlung oder Koch- und Gefrierbehandlung
Eukaryoten: Zerkleinert → Das Gleiche wie oben
DNA isolieren und reinigen
Zellflüssigkeit nach der Lyse → + Proteindenaturierungsmittel [Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol/SDS...] (Denaturierung von Protein) → Zentrifugation (Entfernung von Verunreinigungen wie Protein) → organisches Lösungsmittel [Ethanol/Isopropylalkohol] (Aggregation und Ausfällung von DNA) → Lösung entfernen → Roh-DNA → Weitere Reinigung [Phenol/Chloroform: Extraktion, 70 % Ethanol]
Erkennung: Gelelektrophorese-Technologie
Prinzip
Mobilität
Migrationsgeschwindigkeit elektrophoretischer Moleküle in einem elektrischen Feld
Proportional zur elektrischen Feldstärke und der eigenen Nettoladung
Umgekehrt proportional zum Reibungskoeffizienten dielektrischer Moleküle
Das DNA-Rückgrat selbst ist negativ geladen und bewegt sich im elektrischen Feld in Richtung der positiven Elektrode;
Unterschiedliche DNA-Molekulargewichte und -Konfigurationen sind unterschiedlich → die elektrophoretische Mobilität ist unterschiedlich → verschiedene Zonen.
Trennen Sie die Bestandteile einer Mischung aus Proteinen oder Nukleinsäuremolekülen.
Typ
Agar-Gel-Elektrophorese
„Klein, breit“: Trenngrad: schlecht; Trennbereich: besser als
Polyacrylamidgel
Je höher die Gelkonzentration, desto kleiner sind die Poren und desto stärker ist das Auflösungsvermögen.
Werkzeugenzym
Restriktionsendonuklease
Konzept
Substrat: zirkuläre oder lineare doppelsträngige DNA
Erkennung: Spezielle Nukleotidsequenzen
Bruch: (geeignete Reaktionsbedingungen) spezifische Phosphodiesterbindungen jeder Kette
Produzieren: DNA-Fragmente der 3'-OH- und 5'-P-Gene
Endodeoxyribonuklease
Typ
Typ-I-Enzym
Die Erkennungsstelle ist weit entfernt, willkürliche Spaltung, geringe Spezifität, erfordert Cofaktoren
Enzym Typ II ✓
Erkennungsstelle: spezifische Stelle in/in der Nähe der definierten Stelle, spezifische Spaltung, starke Spezifität, konsistente Erkennungs- und Spaltungssequenz, keine Notwendigkeit für Cofaktoren oder nur Mg2
Enzym Typ III
Beim Schneiden außerhalb der Erkennungsstelle ist die Erkennungsstelle eine umgekehrte Wiederholungssequenz, unregelmäßig und erzeugt selten vollständig geschnittene Fragmente
Benennungsprinzipien
Zusammensetzung: Stammnummer, Stammname, Isolationssequenz
Der erste Buchstabe des Gattungsnamens wird großgeschrieben, die ersten beiden Buchstaben des Artnamens werden kleingeschrieben und die Reihenfolge der Trennung (römische Buchstaben)
Mechanismus
Erkennungssequenz
Restriktionsenzyme können spezielle Nukleotidsequenzen auf doppelsträngiger DNA erkennen.
Das gleiche Molekül ist kurz und hat eine hohe Auftrittswahrscheinlichkeit.
Wirkungsweise
Schneideigenschaften des Enzyms
Erkennungslänge
4~8 Basenpaare
Schnittposition
Erkennen Sie das Innere oder beide Seiten der Sequenz
Struktur identifizieren
Palindrom
Art des Enzyms
Seltener Würfelschneider
Isoschiase
Die Erkennungssequenz ist dieselbe
Homogenase
Die Erkennungssequenzen sind unterschiedlich, es werden jedoch die gleichen klebrigen Enden erhalten
Schneidmethode
Klebrige Enden (versetzte Schnitte)
5' klebriges Ende (5' kurz)
3' klebriges Ende (3' kurz)
Flache Enden (bündig abschneiden)
Reaktionssystem
Reaktionssubstrat (DNA)
Endonuklease-Dosierung (bestimmt durch Aktivität)
Reaktionspuffer (optimaler pH-Wert 7,5)
Angemessene Temperatur (meistens 37℃)
Identifizierung des Enzymverdaus: Gelelektrophorese-Technologie
DNA-Ligase
Konzept
Katalyse: zwischen den benachbarten 3'-OH- und 5'-P-Enden des DNA-Moleküls
Es entsteht eine Phosphodiesterbindung
Das heißt: die einzelsträngige Lücke zwischen benachbarten Nukleotiden auf doppelsträngiger DNA schließen.
Es gibt zwei Haupttypen von
E. coli-DNA-Ligase
Klebriges Ende, erfordert Cofaktor: NAD
Das gleiche Restriktionsenzym oder zwei homogene Enzyme
T4-DNA-Ligase
Klebrige Enden, flache Enden, erfordert Cofaktor: ATP
Das gleiche oder zwei Restriktionsenzyme
Verbindungen mit nicht klebrigen Enden und nicht flachen Enden
Exonuklease
flache Enden
terminale Nukleotidyltransferase
In komplementäre klebrige Enden umgewandelt
alkalische Phosphatase
Modifizieren Sie 5'-P zu 5'-OH, um eine Selbstzyklisierung des Trägers zu verhindern
Die wichtigsten Verbindungsmethoden der DNA
Homologe Endonuklease → klebriges Ende
Homotailase→klebriges Ende
verschiedene klebrige Enden
Flach schneiden, flach füllen
Künstliche klebrige Enden – 5 hervorstehende Enden
Bilde das Level
Künstliche klebrige Enden – 3 hervorstehende Enden
Künstliche klebrige Enden – flache Enden
Ersetzen von klebrigen Enden
Andere Werkzeugenzyme
DNA-Polymerase
PCR-Amplifikation
umgekehrte Transkriptase
Erstellen Sie eine cDNA-Bibliothek
T4-Polynukleotidkinase
S1-Nuklease
Vorbereitung des Zielgens
Zielgen
Konzept
☞Ein bestimmtes Gen/DNA-Fragment, das isoliert, transformiert, amplifiziert und exprimiert wurde/werden soll, kann ein bestimmtes Produkt/Merkmal kodieren
Auch bekannt als: Spezialgen oder Zielgen
Quelle
Eukaryotisches Chromosomen-Genom (Mensch und Tier)
Chromosomen von Prokaryoten
Plasmid, Virus
Mitochondrien, Chloroplasten...
Methode
Direkte Zersetzungsmethode
Prinzip
Chromosomale DNA → Restriktionsendonuklease: Schneiden → Alle Fragmente verknüpfen → Ein bestimmter Vektor → In E. coli übertragen → Vermehren → Screening mit geeigneten Methoden → Rekombinante Kolonien, die das Zielgen enthalten → DNA extrahieren → Enzymverdau → Erhalten Sie das Zielgen.
Objekt
Prokaryontische Genome sind klein, Gene sind leicht zu lokalisieren oder DNA-Moleküle mit bekannten Nukleotidsequenzen.
Vorteil
Schnell und einfach, die Produktreinheit ist hoch. Zielgen
Genbibliotheksmethode
Prinzip
Alle genetischen Informationen des Genoms eines bestimmten Organismus → Klonierungsvektor → Speicherung: eine Klon-Subpopulation von Empfängerbakterien (die Genombibliothek dieses Organismus).
Die Gruppe der Empfängerbakterien, die alle Gene im Genom eines bestimmten Organismus enthält, wird als Genombibliothek des Organismus bezeichnet
chemische Synthese
Wenn die Sequenzinformationen bekannt sind, ist dies der bequemste Weg, das Zielgen zu erhalten!
PCR-Amplifikationsmethode (Polymerase Kettenreaktion)
Substanz
In-vitro-Simulation der In-vivo-DNA-Replikation
Prinzip
Zyklus
Transsexuelle
94℃
Erhitzen/alkalisch, DNA-Doppelstrang → Wasserstoffbrückenbindung → Einzelstrang
Glühen
55℃
Template- und Primer-Renaturierung
verlängern
72℃
Spezifische DNS-Sequenz: geometrisches exponentielles Wachstum
PCR-Reaktionsprozess/Reaktionsschritte
Denaturierung der Template-DNA
Nachdem die Matrizen-DNA für einen bestimmten Zeitraum auf 94–95 °C erhitzt wurde, wird die doppelsträngige DNA der Matrizen-DNA oder die durch PCR-Amplifikation gebildete doppelsträngige DNA in einen Einzelstrang dissoziiert, sodass sie daran binden kann den Primer und bereiten Sie ihn auf die nächste Reaktionsrunde vor;
Annealing (Renaturierung) von Template-DNA und Primern
Nachdem die Matrizen-DNA erhitzt und zu einem Einzelstrang denaturiert wurde, sinkt die Temperatur auf etwa 55 °C und der Primer paart sich mit der komplementären Sequenz des Matrizen-DNA-Einzelstrangs;
Primerverlängerung
Unter der Wirkung der Taq-DNA-Polymerase verwendet das DNA-Template-Primer-Konjugat dNTP als Reaktionsrohmaterial und die Zielsequenz als Template. Gemäß den Prinzipien der Basenpaarung und der semikonservativen Replikation entsteht ein neuer semikonservativer Replikationsstrang, der komplementär ist zum Template-DNA-Strang wird synthetisiert.
PCR-Reaktionssystem
Reaktionspuffer
Substrat: dNTP (4 Arten von Desoxynukleotiden: dATP, dGTP, dTT, dCTP)
Grundierungen×2
Vorlage: DNA-Molekül
Taq-Enzym (DNA-Polymerase)
Mg2 (Enzym-Cofaktor)
PCR-Eigenschaften
hohe Empfindlichkeit
Starke Spezifität
Einfach, schnell und reproduzierbar
Geringe Anforderungen an die Probenreinheit
Träger
Das Konzept des Genträgers
Werkzeuge oder Träger, die fremde DNA oder Zielgene in geeignete Wirtszellen einschleusen
Der Spediteur sollte die Bedingungen erfüllen
Die relative Molekülmasse ist klein und für die Aufnahme des Zielgens geeignet;
Es kann eine unabhängige und stabile Selbstreplikation innerhalb der Wirtszelle durchführen und dennoch eine stabile Replikation und genetische Eigenschaften aufrechterhalten, wenn fremde DNA eingefügt wird.
Es kann auswählbare Marker für Wirtszellen (Rezeptoren) bereitstellen und identifizierbare phänotypische Merkmale für ein einfaches Screening aufweisen;
In seiner DNA-Sequenz gibt es eine geeignete einzelne Restriktionsendonuklease-Schnittstelle. Diese Stelle befindet sich in der nicht-essentiellen Region für die DNA-Replikation. Das heißt, nach dem Schneiden durch eine bestimmte Restriktionsendonuklease kann die Plasmid-DNA geschlossen und geöffnet werden Beschaffen Sie sich fremde DNA-Fragmente, ohne Ihre eigenen Fragmente zu verlieren.
Plasmid
Konzept
Doppelhelix-DNA-Molekül mit geschlossenem Kreis
Es ist für die Replikation und Vererbung unabhängig von den Chromosomen und für die Replikation und Transkription auf vom Wirt kodierte Enzyme und Proteine angewiesen.
Gegen Chromosomen
Alles im Zusammenhang mit der biologischen Genetik
Chemisch anders
Chromosomen: Protein und DNA
Plasmid:DNA
Typ
Enger Typ
Es gibt nur ein Exemplar, höchstens aber nur wenige Exemplare.
Entspannt
Häufig verwendete Plasmidvektoren
Escherichia coli-Plasmidvektor
Zwei Antibiotika-Resistenzgene
Lactose-Operon: lacZ-Gen → β-Galactosidase → Hydrolyse X-Gal (lacZ-Blau-Weiß-Spot-Screening)
Plasmid-DNA-Extraktion
selektive Extraktion
Unter milderen Bedingungen wird Lysozym zur Lyse von Bakterien verwendet und die resultierenden Zellfragmente werden durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation aufgrund der Unterschiede im relativen Molekulargewicht zwischen chromosomaler DNA und Plasmid-DNA getrennt. Plasmid-DNA mit relativ geringem Molekulargewicht verbleibt im Überstand und wird mit Ethanol ausgefällt, um rohe Plasmid-DNA zu erhalten.
Alkalische SDS-Methode
Es denaturiert selektiv die offensträngige Doppelhelix-DNA im Chromosom im pH-Bereich von 12,0–12,5, während die doppelsträngige DNA mit geschlossener Schleife unverändert bleibt. Nach der Neutralisierung mit Natriumacetat führt SDS zur Ausfällung des Protein-SDS-Komplexes und der DNA mit hoher relativer Molekülmasse. Anschließend verbleibt die Plasmid-DNA im Überstand und wird durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt.
Plasmid-DNA-Reinigung
Alkalische Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
Offensträngige chromosomale Doppelhelix-DNA wird leicht denaturiert, während doppelsträngige Plasmid-DNA mit geschlossenem Kreis nicht leicht denaturiert wird. Im Saccharosekonzentrationsgradienten setzt sich Plasmid-DNA schneller ab als denaturierte DNA und wird abgetrennt und gereinigt.
Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid (Et-Br)-Dichtegradientenzentrifugationsmethode
Die offensträngige DNA der Doppelhelix des Chromosoms lässt sich leicht mit dem Farbstoff Et-Br verbinden und die Dichte ist nicht für die Bindung geeignet, da sie fest verschlossen ist durch Zentrifugation.
Methode zur Adsorption von Nitrozellulosemembranen
Die Nitrozellulosemembran adsorbiert einzelsträngige DNA und chromosomale DNA lässt sich leicht denaturieren, um einzelsträngige DNA zu bilden, die von der Plasmid-DNA getrennt wird.
Transformieren und aufbauen
Löschen Sie nicht wesentliche Bereiche
Fügen Sie neue genetische Markergene hinzu
Führen Sie DNA-Sequenzen mit mehreren Erkennungs- und Spaltungsstellen für Restriktionsenzyme ein, d. h. mit mehreren Klonierungsstellen
Lambda-Phage
Phagen
Es kann sich nicht unabhängig von Wirtszellen vermehren und kann nur in lebenden Zellen wachsen und ist streng spezifisch für Wirtszellen.
Haupttypen
Vektor einfügen
Ersatzvektor
Andere Träger
genetische Rekombination
Konzept
Zielgen & Vektor: In-vitro-Kombination → rekombinant.
Reorganisationsmethode
Hauptsächlich klebrige Enden
direkte Verklebung
Einfach und effizient
Fügen Sie Schwanzbindung hinzu
Verwendung der terminalen Nukleotidyltransferase zur Erzeugung klebriger Enden an DNA-Enden
Hauptwerkzeugenzym: T4-DNA-Ligase (5'-P und 3'-OH)
DNA-Rekombination
① Ligation klebriger Enden, die von derselben Endonuklease erzeugt werden
② Ligation von klebrigen Enden, die durch homozygote Enzyme erzeugt werden
③Verbindung verschiedener Klebeenden
④Verbindung künstlicher Klebeenden (5‘ überstehendes Ende, 3‘ überstehendes Ende, flaches Ende)
⑤ Austausch des Klebeendes
Rekombinationsrate = Index der Rekombinationskomponenten, die exogene DNA enthalten / Anzahl der Vektormoleküle, routinemäßige experimentelle Bedingungen: 25–75 %
Gentransformation und -expression
Das Zielgen wird in Empfängerzellen eingeführt
Wirtszelle (Rezeptorzelle)
Konzept
Zellen, die während der Transformation, Transduktion und Hybridisierung fremde Gen-DNA erhalten
ist ein rekombinanter Amplifikationsort
Typ
Prokaryotische Zellen
Escherichia coli, Bacillus subtilis
eukaryontische Zellen
Hefe (hauptsächlich)
Merkmale
Einzellig
Nicht pathogen, sicher
Kompetenz
Kompetenz
Wirtszellen können exogene DNA-Moleküle absorbieren und in bestimmten physiologischen Zuständen effektiv als Transformationsrezeptoren fungieren.
es hängt davon ab
Der physiologische Zustand der Rezeptorzelle selbst
Konfiguration und Größe rekombinanter DNA-Moleküle
Allgemeine Wirtszellen in der logarithmischen Wachstumsphase: Transformationsfähigkeit max
kompetente Zellen
Zellen in einem physiologischen Zustand, die externe DNA-Moleküle aufnehmen können.
Konvertieren
Ca2-induzierte Transformation intakter Bakterienzellen
Elektroporationstransformation
Wechselkurs
Konzept
Beeinflussende Faktoren
Verstärkungsscreening
verstärken
Screening-Methode
Screening basierend auf Vektor-Antibiotikaresistenzgenen und entsprechenden ausgewählten Arzneimitteln
Screening-Methode zur Transformation von Escherichia coli mit einem Plasmidvektor, der doppelte Antibiotikaresistenzmarker trägt
Träger: Amp (resistent gegen Ampicillin), Tet (resistent gegen Tetracyclin)
Ein fremdes Gen wird in eines der Antibiotikaresistenzgene eingefügt, was zu dessen Inaktivierung führt
Zwei Antibiotikaplatten zum Screening von Rekombinanten
Schritt
①Positive Auswahl
Enthält Antibiotika, die nicht eingefügten inaktivierten Resistenzgenen entsprechen
Transformant√
Transformant, der ein Plasmid enthält, das das Zielgen enthält √
Transformant, der ein rekombinantes Zielgen enthält √
Nichttransformant ×
②Negative Auswahl
Antibiotika, die durch Insertion inaktivierte Resistenzgene enthalten
Nicht rekombinante Transformanten, die das Zielgen nicht enthalten√
Transformanten, die Rekombinanten von Zielgenen enthalten ×
Vergleich der beiden Medien → Auswahl: Transformanten, die Rekombinanten des Zielgens enthalten
Screening mit dem lacZ-Gen des Lactose-Operons (blau-weißer Fleck)
Bakterien mit einem vollständigen Lactose-Operon können das LacZ-Gen, das für β-Galactosidase kodiert, übersetzen → X-Gal hydrolysieren → blau
Fremdgeninsertion → LacZ-Gen kann nicht exprimiert werden → weiß
Erforderlich: Kein inaktiviertes Antibiotika-Resistenzgen eingefügt → Ampicillin-Kulturmedium
Transformant, der ein Plasmid enthält, das das Zielgen enthält: Stamm blau
Transformant mit rekombinantem Zielgen: Stamm weiß
Anwendung eines DNA-Chips zur Identifizierung von Rekombinanten
Viele spezifische DNA-Oligonukleotide/DNA-Fragmente (Sonden) → fest: voreingestellte Position des Chips
Zu testende Probe: beschriften → mit Chip hybridisieren (Prinzip der komplementären Basenpaarung) → Hybridisierungssignal erkennen & Computeranalyse
Screening basierend auf Zielgentranslationsprodukten (Proteine, Enzyme, Polypeptide) [Kein Markergen oder Sonde kann nicht synthetisiert werden]
Protein-Gelelektrophorese
SEITE
Immunoassay
ELISA
Western Blot
Immunpräzipitation
Festphasen-Radioimmunoassay
Expression des Zielgens
Anwendungen in der Lebensmittelindustrie: gentechnisch veränderte Lebensmittel
gentechnisch veränderte mikrobielle Nahrung
Definition
Technische Bakterien
Merkmale
Anwendung
(1) Verbesserung der Qualität von Lebensmitteln
(2) Vereinfachen Sie den Produktionsprozess und verkürzen Sie den Produktionszyklus
(3) Antibakterielle und antiseptische Konservierung von Lebensmitteln
(4) Verbesserung der Enzymproduktionsbakterien in Lebensmittelqualität
(5) Herstellung funktioneller Zutaten für gesunde Lebensmittel
(6) Schneller Nachweis von Lebensmittelmikroorganismen
gentechnisch verändertes Tierfutter
Beteiligte Typen
Hauptanwendung
Laichrate von Nutztieren ändern;
Verbessern Sie die Nährstoffzusammensetzung von Milchprodukten, insbesondere für Säuglinge und Kleinkinder
Produktion von menschlichen Serumproteinen usw. durch Bioreaktoren.
gentechnisch veränderte pflanzliche Lebensmittel
Definition
Typ
Anwendung
Verbessern Sie die Qualität der Lebensmittelzutaten
Verbessern Sie die Lebensmittelproduktionsprozesse
Herstellung von Lebensmittelzusatzstoffen und funktionellen Lebensmitteln