Reconhecer sequências específicas de 4-8 pares de bases em moléculas de DNA de fita dupla

Os locais de clivagem da maioria das enzimas estão dentro ou em ambos os lados da sequência de reconhecimento.

Identifique a sequência de clivagem como uma estrutura clássica de palíndromo rotacionalmente simétrica

Cliva o DNA para produzir extremidades contendo grupos 5' fosfato e 3' hidroxila

Cortes deslocados produzem pontas pegajosas, cortes ao longo do eixo de simetria produzem pontas planas

A maioria das enzimas do tipo II requer condições de reação semelhantes

Hidrólise enzimática combinada multienzimática

Impurezas: proteínas, fenol, clorofórmio, etanol, EDTA, SDS, NaC, etc.

Abordagem

Certas endonucleases de restrição requerem muitas vezes mais enzimas para clivar o DNA plasmídico superenrolado ou DNA viral do que para digerir o DNA linear.

Algumas endonucleases de restrição de ácidos nucleicos cortam locais de enzimas de restrição em diferentes posições, e a sua eficiência também é significativamente diferente.

Atividade da DNA polimerase 5'->3'

Atividade de exonuclease 5'->3'

Atividade de exonuclease 3'->5'

Tradução de Nick: As atividades de exonuclease e polimerase 5'->3' trabalham juntas para avançar o corte.

Preparação de sondas de DNA marcadas com 32P

Fonte: DNA polimerase de Escherichia coli Ⅰ é tratada com subtilisina para obter o terço N-terminal do grande segmento peptídico, que é a enzima Klenow

Tem atividade de DNA polimerase 5'->3' Tem atividade de exonuclease 3'->5' Perda de atividade de exonuclease 5'->3'

1||| Preencha as extremidades adesivas 5' geradas por endonucleases

2||| Rotulagem final isotópica de fragmentos de DNA

3||| Síntese da segunda fita de cDNA

4||| Determinação da sequência de DNA pelo método de terminação final da cadeia didesoxi

① 5'->3' atividade da DNA polimerase ② 3'->5' atividade da polimerase exonucleolítica ③ Falta de atividade de exonuclease 5'->3' ④ Na ausência de dNTP, a exoclivagem pode ser realizada a partir de qualquer extremidade 3'-OH ⑤ Quando existe apenas um tipo de dNTP, a exólise para quando o nucleotídeo complementar é exposto. ⑥ Quando todos os quatro dNTPs estão presentes, a atividade de polimerização domina

①Corte a extremidade adesiva 3' gerada pela endonuclease

② Rotulagem final isotópica de fragmentos de DNA

① 5'->3' atividade da DNA polimerase ② Atividade de exonuclease 3'-> 5' ③ Tem a processabilidade mais forte entre as DNA polimerases conhecidas ④ Após a modificação, torna-se uma enzima de sequenciamento para fragmentos longos de DNA usando o método de terminação da cadeia didesoxi.

Reações de extensão de primer para fragmentos de DNA mais longos

Rotulagem final rápida por meio de reações de preenchimento ou troca (deslocamento)

Fonte: timo de bezerro

A DNA polimerase livre de modelo incorpora aleatoriamente dTNP na extremidade 3'-OH

Adicione caudas de homopolímero complementares ao vetor ou DNA alvo

Marcação isotópica das extremidades 3' dos fragmentos de DNA

(1) síntese de cDNA guiada por RNA

(2) Excisão bidirecional da fita de RNA na fita híbrida DNA-RNA (atividade RNase H)

(3) Atividade de polimerização de DNA guiada por DNA

AMV: uma enzima transcriptase reversa derivada do vírus do mieloblastoma aviário purificado (funciona a 42°C)

MMLV: Um produto de expressão do gene da transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (MMLV) em E. coli (funciona a 37°C)

Transcrever o RNA de genes eucarióticos em DNA e construir uma biblioteca de cDNA

Avaliar e rotular a extremidade 3' dos fragmentos de DNA com saliências 5' e preparar sondas

Substitui o fragmento Klenow para sequenciamento de DNA

Remova o grupo fosfato da extremidade 5' do DNA do vetor para evitar que o vetor se ciclize e melhore a taxa de recombinação

Remova os grupos fosfato 5' do DNA e RNA e, em seguida, marque a extremidade com polinucleotídeo quinase T4

① Endocução de DNA ou RNA de fita simples

② DNA ou RNA de fita dupla com cortes ou fendas dentro dele

① Remova a saliência de fita simples do fragmento de DNA e torne-a uma extremidade romba ② Remova a estrutura em gancho formada durante a síntese de cDNA ③ Analise a quantidade de mRNA por meio do experimento de proteção de nuclease S1 ④ A hibridização de mRNA maduro e DNA genômico, combinada com a hidrólise por esta enzima, pode localizar íntrons ⑤ Apare as extremidades das mutações de exclusão progressiva