マインドマップギャラリー 毒性学 4 毒性学実験の基礎
この図では、毒物実験の原理と限界、毒物実験の基本的な目的、実験動物の選択と管理、動物実験方法、毒物実験結果の統計解析、毒物実験の品質管理を紹介します。みんなに役立ちます!
2024-02-18 11:49:24 に編集されましたThis article discusses the Easter eggs and homages in Zootopia 2 that you may have discovered. The main content includes: character and archetype Easter eggs, cinematic universe crossover Easter eggs, animal ecology and behavior references, symbol and metaphor Easter eggs, social satire and brand allusions, and emotional storylines and sequel foreshadowing.
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毒性学 4 毒性学実験の基礎
授業後の復習質問
1. 動物実験の結果を人間に当てはめる際の不確実性の理由は何ですか?
2. 毒物学的実験の計画において従うべき基本原則は何ですか?
3. 実験結果が生物学的意義を持つかどうかを判断するにはどのような問題を考慮する必要がありますか?
毒物学実験の種類と目的は何ですか?
インビトロ実験
スクリーニング、毒性の予測、メカニズムの探索
生体内実験
毒性評価:動物→人間
人口調査
動物実験結果の検証
1. 毒物学実験の原理と限界
1. 毒物学実験の基本原理
1. 実験動物への影響は人間にも推定できる
①最も敏感な動物種は人間です。
②人間や実験動物の生物学的過程や化学代謝は体重や体表面積に関係しています。
上記の 2 つの仮定は、すべての実験生物学と医学の前提です。
2. 実験動物は高線量に曝露されなければならない
定性的反応の定義によれば、集団効果の発生率は曝露レベルが増加するにつれて増加します。
3 つ以上の用量グループを設定し、用量反応関係を観察します。
LOAEL と人間の被ばく線量の間の距離が大きいほど、安全性は高くなります。
3. 実験対象は健康な成人動物です。
健康な成体動物は一般集団の代表的な実験モデルとして機能し、実験結果を代表的かつ再現可能にします。
4. 中毒経路は、人体への曝露経路の可能性があります。
2. 毒物学実験の限界
動物実験から人間への推定は不確実である
高線量を低線量に推定することには不確実性がある
少数の動物から多数の人間への外挿は不確実である
通常は健康な成体動物が使用され、反応は比較的簡単です。
3. 動物実験の「3R」原則と倫理
「3R」の原則
交換
実験目的を達成するために動物以外の方法で行われる実験や研究を使用する科学的方法、または意識のある脊椎動物の代わりに感覚を持たない実験材料を実験に使用する科学的方法。
削減
より少ない動物で同じ量の実験データを得る方法、または一定の数の動物でより多くの実験データを得る方法。
洗練
動物の痛みや不快感を緩和または軽減し、動物福祉を提供するための実験手順を改善および完成させる方法。
動物実験における倫理問題
法
「マーチン法」「実験動物の管理等に関する規則」
原則を遵守する
実験動物の人道的な管理と治療を提供し、実験動物の苦痛や不快感を最小限に抑える。
人体実験の倫理原則
インフォームド・コンセントの原則
無害の利益の原則
医療目的の原則
科学的原理
実験制御原理
2. 毒物学実験の基本的な目的
安全性評価の基本的な目的
試験物質の毒性効果と特性を観察する
用量反応(効果)関係研究
毒性の標的臓器を決定する
ダメージの回復可能性を判断する
毒物学実験のその他の目的
毒性影響を高感度に検出するインジケーター
生物学的マーカー
中毒のメカニズム
被験物質の毒性動態
被験物質の代謝と中毒救済措置
3. 実験動物の選定と管理
実験動物
明確な遺伝的背景と明確な起源を持ち、人工的に飼育され、その動物が保有する微生物が管理された動物。主に科学研究、医薬品や生物由来製品の有効性と安全性の評価、教育に使用されます。
実験動物種の選択
通常、げっ歯類と非げっ歯類の 2 つの種を選択します。
基本原則
① 代謝的、生化学的、毒物学的特性がヒトと類似している
②自然寿命の短縮
③管理・運用が簡単
④経済的で入手しやすい
実験動物系統の選択
系統: 実験動物学の固有用語で、計画的な交配方法によって同じ祖先に由来する動物のグループ、または同じ祖先に由来し特定の遺伝子型を持つ動物、植物、微生物を指します。
遺伝子制御による実験動物の分類
近交系
20世代以上にわたって兄弟や親子の間で交配を続けて育種された純粋な動物の系統。たとえば、マウスには BALB/C、Jinbai I、Jinbai II などがあります。
ハイブリッドグループ動物(クロス1世代、F1)
2 つの異なる近交系の目的を持った交配から生まれた動物の第一世代。明らかな遺伝性と雑種の強勢があります。
クローズドグループ
集団とは、5年以上外部から新たな血液を導入せず、一定の場所でランダムに交配・繁殖した同じ系統の動物の集団だけをいいます。昆明マウス、NIHマウス、Wistarラットなど。毒物学の研究で最もよく使用されます。
実験動物の微生物制御パラメータ
従来の動物 (CVA)
クリーンアニマル (CLA)
毒性試験および毒性研究では、実験結果の信頼性を確保するために、CLA 以上の動物を使用する必要があります。
特定病原体無菌動物 (SPF)
無菌動物 (GFA)
実験動物の微生物グレード基準
レベル I: CVA、オープンシステム、人に伝染する可能性のある伝染病はありません。
レベル II: CLA、バリア システム。レベル I の基準に加えて、種の境界が明確であり、動物に特有の感染症がない。
レベル III: レベル II の基準に加えて、純粋な系統の要件に従って飼育され、アイソレーターまたは層流室で飼育された SPF、バリアーまたは隔離システムには、非病原性細菌コロニーが存在する可能性がありますが、病原性病原体は存在しません。
レベル IV: GFA、隔離システム、動物の外部に微生物や寄生虫 (ほとんどのウイルスを含む) が存在しない、完全に閉鎖された無菌条件下で飼育された純粋な動物。
実験動物の個別選択
性別
年齢と体重
生理的状態
健康状態
実験動物施設構造
動物の受付および検疫エリア
動物の餌やりと実験エリア
飼料、寝具、消耗品の保管場所
洗浄・消毒エリア
廃棄物保管および処理エリア
管理エリア
実験動物施設の種類
オープンシステム: 通常の環境
バリアシステム:クラス10,000のクリーン度
隔離システム: レベル 100 の清浄度
4. 動物実験の方法
動物実験計画の原則
ランダム化原理
完全にランダム化(単一因子設計)
層別ランダム化(マッチングデザイン)
コントラストの原理
毒性試験の共通コントロール
未処理のコントロール(ブランクコントロール)
加工要素なし、被験物質なし、操作なし
生物学的特性のバックグラウンド値の決定、品質管理
ネガティブコントロール(溶媒コントロール)
加工要素はなく、必要な実験要素(溶媒)が与えられ、実験要素(溶媒)の影響が排除される。
ポジティブコントロール
既知の陽性結果を使用して、実験システムの有効性をテストします。
遺伝毒性試験、催奇形性試験、発がん性試験にはすべて陽性対照群があります。
自制心
同じ研究対象者を治療の前後で比較しました。たとえば、薬を服用する前後の血圧の変化を観察します。
研究因子処理の前後の実験条件が一貫しており、観察されたパラメータが安定していることが必要です。
過去の比較
これは、同じ研究室での過去の複数の実験からの対照群データで構成されます。
均質性テストを通じて実験システムの安定性を確認し、実験室の品質を管理および保証します。
リピート原理
実験全体の繰り返し
実験結果の再現性を確保します。
複数の被験者を繰り返し観察する
各グループには十分なサンプル サイズが必要です。
動物実験計画のポイント
In Vivo 毒性試験の用量グループ化
各グループの動物の数
試験期間
動物実験前の準備
実験動物を購入した後は、オスとメスを分けて飼育する必要があります。
通常、隔離は5〜7日間行われます。
一般的に使用される実験動物の性別識別
毒物にさらされる前の準備
動物の分類
計量、番号付け、ランダムなグループ化
被験物質の調製
用量グループ、曝露量、希釈
暴露経路の選択
消化管、気道、皮膚、皮下、皮内、筋肉、腹腔、静脈
被験物質の調製
毒物準備
一般的な剤形:水溶液、懸濁液、油溶液
水溶性の試験物質は体内の浸透圧と一致します。
適切な有機溶媒に溶解または懸濁した、水不溶性の被験物質
試験物質は通常、使用前に新たに調製する必要があります。
毒物製剤の準備のポイント
準備するときは、試験対象物をその物理的および化学的特性が変化する温度まで加熱しないでください。
固体被験物質の皮膚毒性を評価するには、その形状と粒子サイズを維持する必要があります。
元の混合物を正確に反映するように、処方に従って多成分の被験物質を調製します。
製剤は化学的安定性と試験物質との一貫性を維持する必要があります
調製では総試験量を減らし、溶媒や賦形剤を多量に使用しないでください。
露出の準備が簡単であること
製剤の pH は 5 ~ 9 が最適です。
試験物質を解離させるために酸や塩基を使用しないでください。
非経口中毒の場合、最終溶液は可能な限り等張である必要があります。
実験動物への曝露経路
経口(胃腸)曝露
飲み込むカプセル
餌やり
経口投与
気道を介した感染
製造条件下でガス、蒸気、粉塵、煙、霧などの形で存在する化学毒の研究および環境大気汚染物質の評価
吸入暴露: 静的および動的
気管内注射:麻酔後に行います。
肌の露出
液体、気体、さらには粉塵状態の化学毒
彼らの多くはウサギやモルモットを選択し、動物の背骨の両側の皮膚を脱毛し、局所的に化学毒を塗布し、ガラスのベルジャー、油紙、またはプラスチックフィルムで覆い、一定期間固定します。時間。
農薬、化粧品、環境汚染物質、外用薬
よく使われるネズミ
暴露の方法
脱毛:化学的または機械的脱毛
毒物暴露: 局所塗布または尾部浸漬法
注射による曝露
腹腔内注射
静脈注射
筋肉注射
皮下注射
生物標本の収集
尿と便の採取
臓器標本採取
胆汁の採取
採血
終わり
非終末期採血
1 回の採血量は動物の総血液量の 15% 未満であり、動物に影響を与えることはありません。
血液量が総血液量の 15% ~ 20% になると副作用が発生します。
24 時間ごとの複数回の採血は、総血液量の 1% を超えてはなりません
麻酔
全身麻酔(ペントバルビタールナトリウム)および局所麻酔(プロカインなど)
安楽死
公的に認められた人道的な方法を用いて動物を殺害し、恐怖や不安を感じることなく静かに痛みを伴わずに死ぬプロセス。
病理学的解剖学と標本収集
病理学的検査は毒性学検査の重要な部分であり、病理学的研究は有害な影響や標的臓器を特定するのに役立ちます。病理学的検査には肉眼解剖学的検査と病理組織学的検査が含まれます。
肉眼解剖学
実験動物が屠殺されてから 30 分以内に、胸部臓器と腹部臓器の複合抽出法を使用して解剖されました。
関連臓器の形状、表面状態、色、境界、大きさ、質感、断面を観察します。
指定された臓器の重さを量り、臓器係数を計算します。
実験動物の病理学的解剖のための標準操作手順
1. 動物を解剖台に固定し、首(耳下腺、リンパ節など)を解剖します。
2. 胸と腰の皮膚の片側を取り、腹部を開いて切開部を拡張します(腹部内臓)
3. 開胸術(胸部内臓、舌・喉、気管、甲状腺など)
4. 左後肢(筋肉など)、頭皮、耳を剥がし、頭蓋骨を開き、脊髄を露出させます。
病理組織学的検査
鋭利なナイフを使用して、指定された臓器または組織を切断し、その部分を一体化します。
組織ブロックは通常、10 倍量の 10% ホルムアルデヒド溶液で固定され、その後日常的に準備されます (組織のパラフィン包埋、切片作成、および HE 染色)。
顕微鏡で観察・記録し、病理診断を行います。
5. 毒性実験結果の統計解析
結果の統計分析
各治療群と陰性対照群間のペアワイズ比較、および複数の治療群と陰性対照群間の比較
用量反応関係と用量反応関係
品質管理チャート
毒性試験の結果を評価する際に答えなければならない質問
それは統計的に有意ですか?
それは生物学的に重要ですか?
毒性学的重要性があるかどうか、つまり有害な影響があるかどうか
生物学的意義を決定する際に考慮すべき問題
縦断的比較: このパラメーターの変化に用量反応関係があるかどうか。
水平比較: このパラメータの変化が他の関連指標の変化を伴うかどうか。
治療グループと対照グループの平均の差は、検出誤差の 2 倍を超えています。
生物学的意義を決定する際に考慮すべき問題
過去の対照との比較: 実験動物の基準正常値は、同じ系統の実験動物と同じ溶媒を使用してこの研究室で最近実施された少なくとも 10 回の独立した実験の陰性対照の結果で構成され、その平均値 ±1.96 × 標準値です。誤差は基準値範囲として使用されます。陰性対照は、過去の対照の平均値の±3×標準誤差以内でなければなりません。
治療群のある観察値を対照群と比較した場合、その差が統計的に有意であり、以下のいずれかの条件を満たす場合には、正常な基準値の範囲を超えており、悪影響であると考えることができます。
①正常な基準値の範囲を超えている場合
②正常な基準値の範囲内であるが、接触を止めた後も差が一定時間継続する
③値は正常な基準値の範囲内ですが、身体が機能的または生化学的ストレス状態にある場合、その差はより顕著になります。
毒性試験結果の統計的有意性と生物学的有意性
6. 毒物学実験の品質管理
適正検査基準 (GLP)
医薬品、食品添加物、農薬、化粧品、その他医療品の毒性評価のために制定された管理規定です。
これは、実験計画、実施、監督、記録、ファイル管理など、人間の健康と環境に関連する非臨床安全性研究のための完全な組織管理システムを規制する規制文書です。
国内外のGLP開発の歴史
先進国は 1960 年代と 1970 年代に GLP を正式に開発し、実施し始めました。
GLP システムを導入している国には、米国、日本、英国、ドイツ、オランダ、スウェーデン、スイスが含まれます。
1980年代後半、我が国は医薬品およびその他の関連製品および毒物に関するGLPの研究と実施作業を相次いで実施しました。
目的と意義
科学技術関係者の研究活動を組織し、管理することを目的としています。
研究者による実験データの品質と妥当性の向上を促進する
実験データの国際的な相互承認を促進する
不必要な実験の重複を避け、リソースの無駄を削減します。
実験結果の信頼性、完全性、再現性を確保する
基本的な内容
組織と人材の要件
実験施設、機器、装置および実験材料の要件
標準作業手順 (SOP)
研究作業の実施プロセスの要件
アーカイブとその管理の要件
検査機関の資格認定および監督検査
SOP標準作業手順書
目的は、操作の再現性と結果の信頼性を確保することです。
教育と訓練を受けた担当者が SOP に従ってテストを実行すると、テスト操作と操作結果の再現性が高くなります。
同じ研究機関や研究室内で、SOP に従って異なる担当者が操作やテストを実行する場合、より一貫した結果を保証できます。
組織体制
品質保証ユニット (QAU—品質保証ユニット)
QAU は、検査機関の業務が GLP 仕様に準拠していることを保証する責任を負う検査機関内の部門または組織を指します。
QAUはGLP構築の鍵となります。さまざまな特定の操作に対する適切な実験計画と SOP があったとしても、必ずしも高品質のテスト結果が保証されるわけではありません。
プロジェクトリーダー(SD-Study Director)
特定の調査または検査作業を組織し、実施する責任者を指します。 SD は検査機関における具体的な組織運営の中核となる人物である。幅広い知識体系と豊富な実務経験を有しています。 SD の栽培と品質は GLP 研究所にとって非常に重要です。
毒性学実験計画の品質管理
in vivo 毒性学実験を設計する際の重要なポイント
In Vivo 毒性試験の用量グループ化
各グループの動物の数
試験期間
in vitro 毒性試験の設計
被験物質の溶解度を検査する
テストする最高用量の推奨 (10 mmol/L または 5 mg/ml)
代謝活性化 (PCB 1254 前処理雄成体ラット肝臓ホモジネート 90000g 遠心上清 (S9) および NADPH 再生システム)
毒物学実験実施時の品質管理
研究室の運営手順と管理
試薬管理
機器管理
環境管理
実験動物の管理
ブラインドマネジメント
品質管理チャート
毒物実験結果の分析の品質管理
実験データの統計解析
実験結果の評価
考える質問
慢性毒性試験はサイクルが長く、多くの動物を消費し、多くの人的資源と物的資源を必要とするため、慢性動物試験の信頼性をどのように確保するか?
研究室の品質管理は、テストの成功と実験データの科学性と正確性を保証するための前提条件です。
慢性毒性試験は、Good Laboratory Practice (GLP) に従って管理される必要があります。
合理的な実験計画、動物の選択と管理、試験物質の調製と管理、実験の操作、試験条件の管理が含まれます。