Fs Gènes centraux de l'horloge circadienne (gènes CC) : ni le régime alimentaire ni l'état microbien de l'intestin n'affectent la rythmicité circadienne et l'amplitude des gènes centraux CC dans les grattages muqueux.

Niveaux de transcription des peptides antimicrobiens : les souris rc-SPF présentaient des niveaux de transcription significativement accrus dans des ZT spécifiques, en particulier chez les membres de la famille REG3, notamment Reg3g et Reg3b, sans différences significatives chez d'autres, tels que LYZ1.

Niveau de traduction : (Méthode : immunomarquage) : un modèle de variation diurne similaire de REG3g a été observé dans le groupe rc-SPF mais pas dans le groupe SPF-hf, alors qu'il n'y avait pas de différence évidente dans les niveaux d'expression ou les niveaux d'oscillation par immunocoloration de LYZ1.

Méthodes : Western blot : découverte d'oscillations REG3γ dépendantes du régime alimentaire et de zt (temps)

Seules les souris 1 à 8 nourries avec RC ont montré une expression de Reg3g dépendante de ZT, alors qu'il n'y avait aucune différence dans l'expression des cryptes de ZT2 et 10 chez les souris nourries avec RC ou HF (Figure 1F)

1. Quel que soit l’état microbien ou le régime alimentaire, le réseau central de gènes CC est stable ; 2. Les rythmes circadiens de l'expression de Reg3g de l'hôte dans les cellules épithéliales villeuses sont déterminés par la présence de microbes intestinaux, y compris de microbes sélectionnés par l'alimentation.

L'HF a augmenté de manière significative l'abondance relative des espèces appartenant au phylum Firmicutes et diminué le phylum Bacteroidetes. Méthodes : Le séquençage de l’amplicon du gène 16SrRNA et l’analyse quantitative de l’écologie microbienne (QIIME) ont été effectués régulièrement sur le contenu de l’iléon distal.

L'analyse de la diversité bêta avec Bray-Curtis a révélé des différences significatives entre les communautés microbiennes RC et HF (Tableau S3)

Bien que le nombre de copies du gène 16SrRNA ait montré des amplitudes similaires chez les souris nourries avec RC et HF, HF a induit un déphasage par rapport à RC (Fig. 2C).

Des différences significatives en OTU ont été observées entre les souris nourries avec RC et HF (Fig. 2D), l'HF augmentant significativement les Clostridiales et diminuant les Bacteroidetes par rapport à la RC (Tableau S2).

Le pourcentage d'OTU oscillants et non oscillants identifiés par eJTK (diagramme circulaire) et le nombre d'OTU oscillants uniques et partagés (diagramme de Venn). 15 % des taxons iléaux oscillaient sous RC et étaient significativement réduits par HF. Un total de 81 OTU oscillatoires uniques ont été observés dans le contenu luminal des souris nourries avec RC, alors que 14 OTU uniques étaient présentes chez les souris nourries avec HF (tableau S4);

Dans des conditions HF, les oscillations annotées selon les genres étaient absentes, l'abondance globale a diminué ou l'oscillation a été perdue par rapport aux OTU RC (Figure 2F).

1. L’IC modifie significativement la richesse microbienne de l’iléon distal 2. HF a sélectionné un groupe de groupes d'oscillations relativement uniques à RC. 3. Malgré la diminution globale des OTU d’oscillation HF

Les résultats de l'analyse de corrélation de Pearson ont montré que seules 3 OTU dans le contenu luminal des souris nourries avec RC et hf étaient significativement corrélées à l'expression de Reg3γ. Il existait une corrélation positive entre l'expression des OTU de Lactobacillus et de Reg3g, tandis que l'expression des OTU des familles Clostridiaceae et Peptidetococcaceae était négativement corrélée (Fig. 2G).

Bien que les OTU corrélées négativement avec Reg3g n'aient pas oscillé chez les souris nourries avec RC ou HF, leur abondance relative était significativement augmentée dans tous les ZT par rapport à RC (Fig. 2H).

L'abondance relative des Clostridiaceae, des Lactobacilliaceae et des Gastrostreptococcus a montré presque les mêmes corrélations positives et négatives avec l'expression de Reg3g (Fig. 2I).

1. Les Lactobacilliaceae sont enrichies en RC et présentent des oscillations 2. Les OTU spécifiques des bactéries lactiques sont positivement corrélées à l'expression quotidienne de Reg3g de l'hôte. 3. L'alimentation HF réduit les oscillations microbiennes et favorise l'expansion globale des Clostridiaceae et des Gastrostreptococcus, qui sont toutes deux négativement corrélées à l'expression de Reg3g.

À ZT10, par rapport au lysat HF, l'exposition au lysat dans la lumière iléale de souris SPF pendant 24 h a induit l'expression de Reg3g dans les cellules entéroïdes de souris WT.

Méthode : Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, famille des Lactobacilliaceae), des streptocoques gastriques anaérobies (clostridiaceae P. stomatis) et des anaérobies orogastriques (LGG, famille des streptocoques orogastriques) ont été utilisés comme milieu conditionné. Résultats : L’exposition des entéroïdes au milieu conditionné LGG pendant 12 heures a induit de manière significative l’expression de Reg3γ (Figure 3B).

Nous avons observé que LGG seul induisait l'expression de Reg3g, alors que P. stomatis seul ne le faisait pas. La co-exposition aux Enterobacteriaceae a inhibé l'induction de Reg3g même en présence de LGG. Ces données indiquent que les bactéries sélectionnées par HF ont un effet inhibiteur sur l'expression de Reg3g quelle que soit l'exposition au milieu conditionné par induction.

Objectif : Détecter si LGG ou P. stomatis nécessitent la signalisation MyD88 pour affecter l'expression de Reg3g (source) Méthodes : Les intestins de SPFMyD88/ou MyD88/littermates ont été exposés à différents milieux conditionnés bactériens. Résultats : LGG a induit de manière significative Reg3g dans MyD88/-, mais pas dans MyD88-/- ; il n'y a eu aucune induction dans les paires de P. stomatis, quel que soit le statut de MyD88 (Figure 3D). Conclusion : LGG a besoin de MyD88

Objectif : Élucider davantage si les petites molécules dérivées de LGG ou de P. stomatis affectent différemment l'expression de Reg3g, Méthodes : Les milieux conditionnés ont été fractionnés (Figure 3E). Résultats : Les petites molécules de moins de 3 kDa dérivées de LGG étaient suffisantes pour induire l'expression de Reg3g, tandis que P. stomatis avait un effet inhibiteur significatif sur toutes les fractions contenant des petites molécules de moins de 30 kDa. Conclusion : Les petites molécules dérivées de LGG induisent Reg3g, tandis que les petites molécules dérivées de P. stomatis inhibent l'expression de Reg3g de manière dépendante de myd88.

Objectif et méthodes : Tester si le traitement thermique d'une fraction moyenne conditionnée par lgg de 3 kDa affecte sa capacité à induire l'expression de Reg3g. Résultats : Dans les cellules entéroïdes de souris SPF-WT, le traitement thermique a entraîné une réduction de 30 à 40 % de la capacité à induire Reg3g par rapport au LGG isolé de 3 kDa non traité (Figure 3F)

1. Les petites molécules dérivées du LGG sont thermiquement instables 2. Des composés spécifiques à la souche peuvent être nécessaires pour induire Reg3g

sous-thème

Pour caractériser et différencier davantage les petites molécules uniques produites par LGG et L. reuteri, nous avons ensuite effectué une analyse par spectrométrie de masse par LC-MS/MS à 3 kDa et un milieu conditionné traité thermiquement (Figure 3G). 3kDa Lactobacillus reuteri présente des caractéristiques uniques par rapport au 3kDa LGG non traité et traité thermiquement

L'analyse des différences et des changements de pli (FC) (p1) a montré : 859 différences uniques de petites molécules entre le LGG de 3 kDa non traité et le LGG traité thermiquement, tandis que le LGG de 3 kDa et le L. reuteri de 3 kDa ont montré 1 439 propriétés différentes uniques, avec un chevauchement de 149 (Fig. 3H). ).

Le tracé du volcan a montré une diminution de l'abondance de petites molécules entre le LGG 3 kDa non traité et le LGG traité thermiquement (7,51 à 6,88), tandis que le LGG de 3 kDa présentait un FC plus grand (10,69 à 9,88) par rapport au L. reuteri de 3 kDa (Figure 3I). Cela suggère que les différences de profils de petites molécules entre LGG et L. reuteri sont supérieures à celles observées après traitement thermique du LGG.

Les 25 molécules les plus abondantes avec la teneur en fc positive et négative la plus élevée par rapport à LGG3kDa sont présentées dans le tableau S5. Bien que l'identité de nombreux métabolites soit inconnue, certains ont été identifiés comme des acides aminés à chaîne ramifiée (tableau S5, surligné en bleu). UN

Bien qu'il soit actuellement incertain quelles petites molécules spécifiques conduisent à l'induction ou à la répression de l'expression de Reg3g, ces données suggèrent qu'il existe des différences significatives dans le profil d'expression de Reg3g de chaque bactérie.

Pour traduire nos résultats in vitro, nous avons associé des souris RCfed-GF à des souches d'acide lactique qui ont une capacité unique à induire l'expression de Reg3g et à des souches qui sont particulièrement résistantes aux propriétés antimicrobiennes de REg3g, à savoir LGG et Lactobacillus reuteri (Figure 3J). . L'expression de Reg3g était significativement augmentée uniquement dans les abrasions de la muqueuse iléale de souris mono-associées à LGG récoltées à ZT10 (expression maximale attendue), mais pas chez les témoins GF ou les souris mono-associées à L. reuteri. Seules les souris mono-associées à LGG présentaient des oscillations de Reg3g, alors que des niveaux d'expression faibles et constants étaient observés chez les souris mono-associées à GF et L. reuteri dans les 3 zt.

Matériel supplémentaire : les souris monoassociées au LGG et leurs homologues GF ont été nourries respectivement avec RC ou HF. LGG-HF a entraîné un gain de poids modeste mais significatif par rapport au LGG-RC 3 et 4 semaines après l'association (Fig. S3E).

La composition du régime alimentaire et des bactéries spécifiques influencent directement Reg3g dans l'iléon distal au cours de la journée, correspondant aux changements dans les résultats métaboliques de l'hôte.

Le régime alimentaire ou le bagage génétique n'ont pas affecté l'expression globale et quotidienne de CC, renforçant ainsi l'indépendance entre le réseau de gènes central de CC et Reg3g (Fig. S4A; Tableau S1).

Dans RCReg3g/souris, l'expression de Reg3g était significativement élevée et augmentait de jour en jour, atteignant un pic à ZT10, alors qu'aucun transcrit n'était détecté dans Reg3g/souris (Fig. 4A).

Reg3g et les autres AMP sont indépendants du noyau CC, et Reg3g semble médier les effets alimentaires sur l'expression et la rythmicité de Muc2

Les souris Reg3g −/− étaient également sensibles à l'obésité induite par le régime HF par rapport aux souris Reg3g/litière, présentant une augmentation de 12 % du poids corporel sur 4 semaines par rapport aux souris nourries par RC (Figure 4B).

1. Par rapport aux contrôles Reg3g/- nourris par RC, les souris Reg3g-/ nourries par RC présentaient une tolérance au glucose significativement moins bonne, une clairance du glucose plus lente et une augmentation de l'aire sous la courbe (ASC). 2. Le taux de clairance de la glycémie de l'IC a été réduit, quel que soit le rapport avec Reg3g/souris nourrie par RC (Figure 4C).

Matériel supplémentaire : Quel que soit le génotype, l'HF a augmenté de manière significative l'abondance relative des Firmicutes, avec une diminution correspondante de l'abondance des Bacteroidetes et un léger changement dans l'abondance des Actinobactéries (Fig. S5A).

L'analyse de la diversité bêta utilisant la distance de Bray-Curtis a montré que l'appartenance à la communauté HF changeait quel que soit le génotype du contenu luminal (Fig. 5A; Tableau S3)

Des différences significatives dans l'appartenance à la communauté ont été observées entre les génotypes, mais uniquement lorsqu'ils étaient nourris avec du RC, indiquant un effet génotype dépendant du régime alimentaire (Fig. 5B, panneau de gauche), qui a été supprimé par HF (Fig. 5B, panneau de droite).

L'abondance relative des Lactobacilliaceae a été réduite chez les souris Reg3g/ nourries avec hf par rapport aux souris Reg3g/ nourries avec du RC, alors que chez les souris nourries avec du RC, les Peptidococcaceae et les Clostridiaceae étaient présentes dans presque tous les ZT, quel que soit le génotype (Fig. 5C). .

Le régime alimentaire remodèle en profondeur le microbiome iléal distal, avec des effets modérés et dépendants du régime alimentaire du REG3g.

Bien que le nombre de copies du gène 16SrRNA ne diffère pas d'un groupe à l'autre, la rythmicité circadienne n'était évidente que chez les souris reg3g-/ nourries au RC (Fig. S5D; Tableau S1).

Par rapport à tous les autres taxons, les taxons oscillatoires présentaient la diversité la plus élevée au niveau ordinal du contenu intraluminal (Fig. 6A, panneau de gauche; Tableau S6). Chez Reg3g/souris, l’HF a entraîné une réduction des lactobacilles et des clostridies oscillants par rapport aux témoins nourris par RC. Cependant, dans Reg3g / souris, HF a réduit les ordres oscillatoires de Bacteroidetes tout en augmentant également les ordres oscillatoires de Clostridiales (Fig. 6A, panneau de gauche; Tableau S6). Nous avons observé que les rayures muqueuses présentaient des propriétés oscillatoires OTU uniques par rapport au contenu luminal (Fig. 6A, panneau de droite; Tableau S6). Quel que soit le génotype, les OTU oscillatoires de RC étaient beaucoup moins diverses par rapport à leur contenu intraluminal (Fig. 6a; Tableau S6).

De nombreuses OTU de Lactobacillus oscillantes ont montré une abondance relative accrue chez les souris nourries par RC, quel que soit le génotype (Figure 6B).