Fs Genes centrais do relógio circadiano (genes CC): nem a dieta nem o estado microbiano intestinal afetam a ritmicidade circadiana e a amplitude dos genes centrais CC em raspados de mucosa

Níveis de transcrição de peptídeos antimicrobianos: camundongos rc-SPF aumentaram significativamente os níveis de transcrição em ZTs específicos, especialmente em membros da família REG3, incluindo Reg3g e Reg3b, sem diferenças significativas em outros, como LYZ1

Nível de tradução: (Método: Imunocoloração): Um padrão de variação diurna semelhante de REG3g foi observado no grupo rc-SPF, mas não no grupo SPF-hf, enquanto não houve diferença óbvia nos níveis de expressão ou níveis de oscilação por imunocoloração de LYZ1

Métodos: western blot: oscilações REG3γ dependentes de dieta e zt (tempo) descobertas

Apenas camundongos alimentados com RC 1-8 apresentaram expressão de Reg3g dependente de ZT, enquanto não houve diferença na expressão de criptas de ZT2 e 10 em camundongos alimentados com RC ou HF (Figura 1F)

1. Independentemente do status microbiano ou da dieta, a rede central do gene CC é estável; 2. Os ritmos circadianos da expressão do Reg3g do hospedeiro nas células epiteliais das vilosidades são impulsionados pela presença de micróbios intestinais, incluindo micróbios selecionados na dieta

A HF aumentou significativamente a abundância relativa de espécies pertencentes ao filo Firmicutes e diminuiu o filo Bacteroidetes. Métodos: O sequenciamento do amplicon do gene 16SrRNA e a análise quantitativa da ecologia microbiana (QIIME) foram realizados regularmente no conteúdo do íleo distal.

A análise de diversidade beta com Bray-Curtis revelou diferenças significativas entre as comunidades microbianas RC e HF (Tabela S3)

Embora o número de cópias do gene 16SrRNA tenha apresentado amplitudes semelhantes em camundongos alimentados com RC e HF, o HF induziu uma mudança de fase em relação ao RC (Fig. 2C).

Diferenças significativas de OTU foram observadas entre camundongos alimentados com RC e HF (Fig. 2D), com HF aumentando significativamente Clostridiales e diminuindo Bacteroidetes em relação a RC (Tabela S2).

A porcentagem de OTUs oscilantes e não oscilantes identificadas pelo eJTK (gráfico de pizza) e o número de OTUs oscilantes exclusivas e compartilhadas (diagrama de Venn). 15% dos táxons ileais oscilaram sob RC e foram significativamente reduzidos pela IC. Um total de 81 OTUs oscilatórias únicas foram observadas no conteúdo luminal de camundongos alimentados com RC, enquanto 14 OTUs únicas estavam presentes em camundongos alimentados com HF, apenas duas OTUs oscilatórias se sobrepuseram em RC e HF (Tabela S4).

Sob condições de HF, as oscilações anotadas nos gêneros estavam ausentes, a abundância geral diminuiu ou perdeu a oscilação em comparação com as OTUs RC (Figura 2F).

1. A IC altera significativamente a riqueza microbiana do íleo distal 2. HF selecionou um grupo de grupos de oscilação que são relativamente exclusivos do RC. 3. Apesar da diminuição geral nas OTUs de oscilação de HF

Os resultados da análise de correlação de Pearson mostraram que apenas 3 OTUs no conteúdo luminal de camundongos alimentados com RC e hf foram significativamente correlacionados com a expressão de Reg3γ. Houve correlação positiva entre a expressão de OTUs de Lactobacillus e Reg3g, enquanto a expressão de OTUs das famílias Clostridiaceae e Peptidetococcaceae foi correlacionada negativamente (Fig. 2G).

Embora as OTUs correlacionadas negativamente com Reg3g não tenham oscilado em camundongos alimentados com RC ou HF, sua abundância relativa foi significativamente aumentada em todos os ZT em relação ao RC (Fig. 2H).

A abundância relativa de Clostridiaceae, Lactobacilliaceae e Gastrostreptococcus mostrou quase as mesmas correlações positivas e negativas com a expressão de Reg3g (Fig. 2I).

1. Lactobacilliaceae são enriquecidas por RC e apresentam oscilações 2. As OTUs específicas das bactérias do ácido láctico estão positivamente correlacionadas com a expressão diária de Reg3g do hospedeiro. 3. A alimentação com HF reduz a oscilação microbiana e promove a expansão global de Clostridiaceae e Gastrostreptococcus, ambos negativamente correlacionados com a expressão de Reg3g.

No ZT10, em comparação com o lisado HF, a exposição ao lisado no lúmen ileal de camundongos SPF por 24 h induziu a expressão de Reg3g em células enteróides de camundongos WT.

Método: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, família Lactobacilliaceae), Streptococcus gástrico anaeróbio (clostridiaceae P. stomatis) e anaeróbios orogástricos (LGG, família Orogastric Streptococcus) foram utilizados como meio condicionado. Resultados: A exposição de enteroides ao meio condicionado LGG por 12 horas induziu significativamente a expressão de Reg3γ (Figura 3B).

Observamos que o LGG sozinho induziu a expressão de Reg3g, enquanto o P. stomatis sozinho não o fez. A co-exposição a Enterobacteriaceae inibiu a indução de Reg3g mesmo na presença de LGG. Estes dados indicam que as bactérias selecionadas por HF têm um efeito inibitório na expressão de Reg3g, independentemente da exposição ao meio condicionado por indução.

Objetivo: detectar se LGG ou P. stomatis requer sinalização MyD88 para afetar a expressão de Reg3g (fonte) Métodos: Os intestinos de SPFMyD88/ou MyD88/irmãos foram expostos a diferentes meios condicionados bacterianos. Resultados: LGG induziu Reg3g significativamente em MyD88/-, mas não em MyD88-/-, não houve indução em pares de P. stomatis, independentemente do status de MyD88 (Figura 3D). Conclusão: LGG precisa do MyD88

Objetivo: elucidar ainda mais se pequenas moléculas derivadas de LGG ou P. stomatis afetam diferencialmente a expressão de Reg3g, Métodos: A mídia condicionada foi fracionada por tamanho (Figura 3E). Resultados: Moléculas pequenas menores que 3kDa derivadas de LGG foram suficientes para induzir a expressão de Reg3g, enquanto P. stomatis teve um efeito inibitório significativo em todas as frações contendo moléculas pequenas menores que 30kDa. Conclusão: Pequenas moléculas derivadas de LGG induzem Reg3g, enquanto pequenas moléculas derivadas de P. stomatis inibem a expressão de Reg3g de maneira dependente de myd88.

Objetivo e Métodos: Testar se o tratamento térmico de uma fração de meio condicionado lgg de 3kDa afeta sua capacidade de induzir a expressão de Reg3g. Resultados: Em células enteróides de camundongos SPF-WT, o tratamento térmico resultou em uma redução de 30% a 40% na capacidade de induzir Reg3g em comparação com LGG isolado de 3kDa não tratado (Figura 3F)

1. Pequenas moléculas derivadas de LGG são termicamente instáveis 2. Compostos específicos de cepas podem ser necessários para induzir Reg3g

sub tópico

Para caracterizar e diferenciar ainda mais as pequenas moléculas únicas produzidas por LGG e L. reuteri, em seguida realizamos análise de espectrometria de massa por LC-MS/MS a 3 kDa e meio condicionado tratado termicamente (Figura 3G) 3kDa Lactobacillus reuteri exibe características únicas em relação ao LGG 3kDa não tratado e tratado termicamente

A análise de diferença e mudança de dobra (FC) (p1) mostrou: 859 diferenças únicas de moléculas pequenas entre LGG 3kDa não tratado e tratado termicamente, enquanto LGG 3kDa e 3kDa L. reuteri mostraram 1439 propriedades diferentes únicas, com uma sobreposição de 149 (Fig. 3H; ).

O gráfico do vulcão mostrou uma diminuição na abundância de moléculas pequenas entre LGG 3kDa não tratado e LGG tratado termicamente (7,51-6,88), enquanto LGG 3kDa mostrou uma FC maior (10,69-9,88) em comparação com 3kDa L. reuteri (Figura 3I). Isto sugere que as diferenças nos perfis de moléculas pequenas entre LGG e L. reuteri são maiores do que aquelas observadas após tratamento térmico de LGG.

As 25 principais moléculas diferencialmente abundantes com o maior conteúdo positivo e negativo de fc em relação ao LGG3kDa são mostradas na Tabela S5. Embora as identidades de muitos metabólitos sejam desconhecidas, alguns foram identificados como aminoácidos de cadeia ramificada (Tabela S5, destacados em azul). A

Embora atualmente seja incerto quais pequenas moléculas específicas conduzem a indução ou repressão da expressão de Reg3g, estes dados sugerem que existem diferenças significativas no perfil de expressão de Reg3g de cada bactéria.

Para traduzir nossas descobertas in vitro, associamos camundongos RCfed-GF com cepas de ácido láctico que têm uma capacidade única de induzir a expressão de Reg3g e cepas que são exclusivamente resistentes às propriedades antimicrobianas de REg3g, ou seja, LGG e Lactobacillus reuteri (Figura 3J) . A expressão de Reg3g foi significativamente aumentada apenas em abrasões da mucosa ileal de camundongos mono-associados a LGG colhidos em ZT10 (pico de expressão esperado), mas não em controles GF ou camundongos mono-associados a L. reuteri. Apenas camundongos mono-associados a LGG exibiram oscilações de Reg3g, enquanto níveis de expressão baixos e constantes foram observados em camundongos GF e L. reuteri-mono-associados em todos os 3 zt.

Materiais suplementares: camundongos monoassociados com LGG e suas contrapartes GF foram alimentados com RC ou HF, respectivamente. O LGG-HF resultou em ganho de peso modesto, mas significativo, em comparação com o LGG-RC às 3 e 4 semanas após a associação (Fig. S3E).

A composição da dieta e bactérias específicas influenciam diretamente o Reg3g no íleo distal durante o dia, correspondendo a alterações nos resultados metabólicos do hospedeiro.

A dieta ou a origem genética não afetaram a expressão geral e diária do CC, apoiando ainda mais a independência entre a rede central do gene CC e o Reg3g (Fig. S4A; Tabela S1).

Em RCReg3g/camundongo, a expressão de Reg3g foi significativamente elevada e aumentou dia a dia, atingindo um pico em ZT10, enquanto nenhum transcrito foi detectado em Reg3g/camundongo (Fig. 4A).

Reg3g e outros AMPs são independentes do núcleo CC, e Reg3g parece mediar os efeitos dietéticos na expressão e ritmicidade de Muc2

Camundongos Reg3g -/- foram igualmente suscetíveis à obesidade induzida por dieta HF em comparação com Reg3g / irmãos de ninhada, exibindo um aumento de 12% no peso corporal ao longo de 4 semanas em comparação com camundongos alimentados com rc (Figura 4B).

1. Em comparação com controles Reg3g/- alimentados com rc, camundongos Reg3g-/ alimentados com rc exibiram tolerância à glicose significativamente pior, depuração mais lenta da glicose e aumento da área sob a curva (AUC). 2. A taxa de depuração da glicose no sangue da IC foi reduzida, independentemente de ser relativa ao Reg3g/camundongo alimentado com rc (Figura 4C).

Materiais Suplementares: Independentemente do genótipo, o HF aumentou significativamente a abundância relativa de Firmicutes, com uma diminuição correspondente na abundância de Bacteroidetes e uma ligeira alteração na abundância de Actinobactérias (Fig. S5A).

A análise de diversidade beta usando a distância de Bray-Curtis mostrou que a adesão à comunidade de HF mudou independentemente do genótipo do conteúdo luminal (Fig. 5A; Tabela S3)

Diferenças significativas na adesão à comunidade foram observadas entre os genótipos, mas apenas quando alimentados com RC, indicando um efeito genotípico dependente da dieta (Fig. 5B, painel esquerdo), que foi ablacionado por HF (Fig. 5B, painel direito).

A abundância relativa de Lactobacilliaceae foi reduzida em camundongos Reg3g/ alimentados com hf em comparação com camundongos Reg3g/ alimentados com rc, enquanto em camundongos alimentados com rc, Peptidococcaceae e Clostridiaceae estavam presentes em quase todos os ZTs foram reduzidos independentemente do genótipo (Fig. 5C). .

A dieta remodela extensivamente o microbioma ileal distal, com efeitos moderados e dependentes da dieta do REG3g.

Embora o número de cópias do gene 16SrRNA não tenha diferido entre os grupos, a ritmicidade circadiana só foi evidente em camundongos reg3g-/ alimentados com rc (Fig. S5D; Tabela S1).

Em relação a todos os outros táxons, os táxons oscilatórios apresentaram a maior diversidade no nível ordinal do conteúdo intraluminal (Fig. 6A, painel esquerdo; Tabela S6). Em Reg3g/camundongos, a IC resultou em uma redução de Lactobacilos e Clostrídios oscilantes em comparação com controles alimentados com rc. No entanto, em Reg3g / camundongo, o HF reduziu as ordens oscilatórias de Bacteroidetes, ao mesmo tempo que aumentou os Clostridiales oscilatórios (Fig. 6A, painel esquerdo; Tabela S6). Observamos que os arranhões da mucosa exibiam propriedades oscilatórias únicas da OTU em relação ao conteúdo luminal (Fig. 6A, painel direito; Tabela S6). Independentemente do genótipo, as OTUs oscilatórias de RC eram muito menos diversas em relação ao seu conteúdo intraluminal (Fig. 6a; Tabela S6).

Muitas OTUs oscilantes de Lactobacillus mostraram abundância relativa aumentada em camundongos alimentados com rc, independentemente do genótipo (Figura 6B).