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Ingeniería genética
Este es un mapa mental sobre ingeniería genética, con una introducción detallada y una descripción completa. Espero que pueda ser útil para los amigos interesados.
Editado a las 2023-11-24 01:34:49,
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- Resumen
Biología-Capítulo 2 Las enzimas como herramientas para la ingeniería genética Mapa mental
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Ingeniería genética
Gene
concepto
Una secuencia de nucleótidos específica que tiene un efecto genético en la molécula de ADN.
Guiar la síntesis de sustancias importantes como las proteínas en el cuerpo humano y mantener las funciones fisiológicas normales del cuerpo humano.
Nivel material: una secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) en un cromosoma.
Nivel funcional: portador de información genética, codifica funciones moleculares de proteínas y ácido ribonucleico (ARN) y regula la expresión génica.
ácido nucleico
Clasificación
ADN (ADN)
Núcleo, mitocondrias, cloroplastos, plásmidos...
portador de información genética
ARN (ARN)
Citoplasma, núcleo
Clasificación
ARN ribosómico (ARNr)
componentes de los ribosomas
Transferencia de ARN (ARNt)
transportar aminoácidos
ARN mensajero (ARNm)
Transmitir información genética del ADN y guiar la síntesis de proteínas.
componentes químicos
Composición del elemento: C, H, O, N, P.
Composición molecular:
base
base de purina
base de pirimidina
El lado interior de la espiral.
pentosa
Ribosa (U)
Desoxirribosa (T)
Ácido fosfórico
El esqueleto de la cadena espiral.
Unidad básica: nucleótido
Una breve historia
Mendel: el experimento del guisante
Descubre las leyes de la herencia: el mismo par de factores se separa y los diferentes pares de factores se combinan libremente
Propuestos por primera vez "factores genéticos" (es decir, genes)
Morgan: Experimentos con Drosophila
genes en los cromosomas
Cadenas genéticas heredadas y ley de intercambio
Watson & Crick: modelo de estructura de doble hélice del ADN
Estructura de doble hélice derecha del ADN
Mecanismo de replicación del ADN: replicación semiconservativa.
Ingeniería genética
La base del nacimiento.
Tres grandes descubrimientos teóricos
El portador de información genética es el ADN, no las proteínas [Experimento de transformación del Pneumococcus pneumoniae]
Modelo de estructura de doble hélice de molécula de ADN y mecanismo de replicación semiconservativo
Dogma central y teoría del operador y decodificación del código genético
Bases teóricas
La estructura básica del ADN en todos los organismos es la misma. Los diferentes genes tienen la misma base material, por lo que los genes pueden recombinarse e intercambiarse.
Los genes pueden cortarse y transferirse, lo que garantiza que la ingeniería genética pueda operar sobre los genes sin afectar sus funciones.
El código genético es universal y existe una correspondencia entre polipéptidos y genes, independientemente de la especie.
Los genes pueden transmitir información genética a la siguiente generación mediante la replicación.
Tres grandes inventos en tecnología.
Tecnología de corte y unión in vitro de moléculas de ADN.
Uso de vectores de ingeniería genética.
Análisis Xu Lei de moléculas de ADN, electroforesis en gel de agar, tecnología de hibridación...
1937: el primer año de la ingeniería genética.
concepto
Se refiere al uso de métodos enzimáticos para recombinar genes heterólogos y ADN portador in vitro, y el ADN recombinante resultante se introduce en las células huésped, de modo que los genes heterólogos puedan replicarse y expresarse en las células huésped, logrando así la transformación del receptor. especies o rasgos biológicos y producción en masa Producir variedades y productos biológicos necesarios para los seres humanos.
También conocida como: clonación molecular o tecnología de ADN recombinante.
contenido principal
Del genoma de un organismo biológico se aísla el fragmento de ADN que contiene el gen de interés.
El fragmento de ADN exógeno que porta el gen diana se conecta a una molécula vector autorreplicante con una marca de selección para formar una molécula de ADN recombinante.
Las moléculas de ADN recombinante se transfieren a las células receptoras apropiadas (células huésped) y se propagan con ellas.
De un gran número de poblaciones de propagación celular, se seleccionan las células receptoras que han obtenido las moléculas de ADN recombinante y se seleccionan los genes diana que han sido amplificados.
El gen diana se clona en un vector de expresión y se introduce en las células huésped para que pueda lograr una expresión funcional bajo un nuevo trasfondo genético y producir sustancias que los humanos necesitan.
proceso basico
Cinco unidades operativas básicas: cortar, conectar, transferir, agregar e inspeccionar
Aislar el ADN que contiene el gen de interés.
Las enzimas de restricción cortan fragmentos de ADN (cortan)
El plásmido se aísla de E. coli y se digiere (digiere)
La ligasa conecta el gen objetivo y el plásmido para la digestión enzimática (conectado a: recombinación de ADN)
Corte y empalme: recombinación in vitro de ADN
Introducir el plásmido recombinante en la célula huésped (transformar)
Clonar el gen objetivo y detectar su expresión (amplificación y detección)
Prueba: Detección e identificación de transformantes.
Transformación y amplificación: transformación y amplificación de moléculas de ADN recombinante.
Genes de cualquier organismo → cualquier otra célula receptora que no tenga nada que ver con él.
Un determinado segmento de ADN → se replica en la célula receptora → prepara una gran cantidad de fragmentos de ADN purificados
Cuatro elementos
enzima herramienta
Gen objetivo (preparación)
vector genético
receptor genético
ADN
Clasificación
ADN cromosómico
Obtener el gen objetivo
ADN plásmido
transportador
Virus, ADN de fago.
Construir vectores de clonación, aislar genes diana y factores reguladores de la expresión genética
ADN del cloroplasto mitocondrial
Obtener el gen objetivo
extracto
Preparación de materiales biológicos.
Rico contenido de ADN con pocas impurezas.
ADN plásmido
Cultivo líquido bacteriano → fase de crecimiento logarítmico tardío
ADN vegetal
Partes jóvenes o plántulas, reducen la acumulación de almidón/azúcar → interfieren con la extracción de ADN
ADN animal
Eliminar áreas con alta actividad enzimática.
células lisadas
Lisis adecuada para evitar roturas de las cadenas de ADN
Procariotas: lisozima, ultrasonido, NaOH, tratamiento con SDS o tratamiento de ebullición, congelación
Eucariotas: triturados → Igual que arriba
Aislar y purificar ADN
Fluido celular después de la lisis → + desnaturalizante de proteínas [fenol/cloroformo/alcohol isoamílico/SDS...] (desnaturalización de proteínas) → centrifugación (eliminación de impurezas como proteínas) → disolvente orgánico [etanol/alcohol isopropílico] (agregación y precipitación de ADN) → Eliminar solución → ADN crudo → Purificación adicional [fenol/cloroformo: extracción, etanol al 70 %]
Detección: tecnología de electroforesis en gel
principio
movilidad
Velocidad de migración de moléculas electroforéticas en un campo eléctrico.
Proporcional a la intensidad del campo eléctrico y a su propia carga neta
Inversamente proporcional al coeficiente de fricción de las moléculas dieléctricas.
La propia columna vertebral del ADN está cargada negativamente y se mueve hacia el electrodo positivo en el campo eléctrico;
Los diferentes pesos moleculares y configuraciones del ADN son diferentes → la movilidad electroforética es diferente → zonas diferentes.
Separar los componentes de una mezcla de proteínas o moléculas de ácido nucleico.
tipo
electroforesis en gel de agar
"Pequeño, ancho": grado de separación: pobre; rango de separación: mejor que
gel de poliacrilamida
Cuanto mayor sea la concentración del gel, más pequeños serán los poros y mayor será el poder de resolución.
enzima herramienta
endonucleasa de restricción
concepto
Sustrato: ADN bicatenario circular o lineal.
Reconocimiento: Secuencias de nucleótidos especiales
Romper: (condiciones de reacción apropiadas) enlaces fosfodiéster específicos de cada cadena
Producir: fragmentos de ADN de los genes 3'-OH y 5'-P.
endodesoxirribonucleasa
tipo
enzima tipo I
El sitio de reconocimiento está lejos, escisión arbitraria, especificidad pobre, requiere cofactores
Enzima tipo II ✓
Sitio de reconocimiento: sitio específico dentro/cerca del sitio definido, escisión específica, fuerte especificidad, secuencia consistente de reconocimiento y escisión, sin necesidad de cofactores o solo Mg2
Enzima tipo III
Al cortar fuera del sitio de reconocimiento, el sitio de reconocimiento es una secuencia repetida invertida, irregular y rara vez produce fragmentos completamente cortados.
Principios de nomenclatura
Composición: número de cepa, nombre de cepa, secuencia de aislamiento
La primera letra del nombre del género está en mayúscula, las dos primeras letras del nombre de la especie están en minúscula y el orden de separación (letras romanas)
Mecanismo
secuencia de reconocimiento
Las enzimas de restricción pueden reconocer secuencias de nucleótidos especiales en el ADN de doble cadena.
La misma molécula es corta y tiene una alta probabilidad de ocurrencia.
Modo de acción
Características de corte de enzimas.
Duración del reconocimiento
4~8 pares de bases
posición de corte
Reconocer el interior o ambos lados de la secuencia.
Identificar estructura
palíndromo
tipo de enzima
Dicer raro
isosquiasa
La secuencia de reconocimiento es la misma.
homogeneización
Las secuencias de reconocimiento son diferentes, pero se obtienen los mismos extremos pegajosos
Método de corte
Extremos pegajosos (cortes escalonados)
Extremo adhesivo de 5' (5' corto)
Extremo adhesivo de 3' (3' corto)
Extremos planos (cortados al ras)
sistema de reacción
Sustrato de reacción (ADN)
Dosis de endonucleasa (determinada por la actividad)
Tampón de reacción (pH óptimo 7,5)
Temperatura adecuada (principalmente 37 ℃)
Identificación de digestión enzimática: tecnología de electroforesis en gel.
ADN ligasa
concepto
Catálisis: entre los extremos adyacentes 3'-OH y 5'-P de la molécula de ADN.
Formado: enlace fosfodiéster
Es decir: sellar la brecha monocatenaria entre nucleótidos adyacentes en el ADN bicatenario.
Hay dos tipos principales de
E. coli-ADN ligasa
Extremo pegajoso, requiere cofactor: NAD
La misma enzima de restricción o dos enzimas homogéneas.
T4-ADN ligasa
Extremos pegajosos, extremos planos, requiere cofactor: ATP
La misma o dos enzimas de restricción.
Conexiones con extremos no pegajosos y extremos no planos
exonucleasa
extremos planos
nucleotidil transferasa terminal
Modificado en extremos adhesivos complementarios.
fosfatasa alcalina
Modifique 5'-P a 5'-OH para evitar que el portador se autocicle.
Los principales métodos de conexión del ADN.
Endonucleasa homóloga → extremo pegajoso
homotailasa → extremo pegajoso
diferentes extremos pegajosos
Cortar plano, rellenar plano
Puntas adhesivas artificiales - 5 puntas sobresalientes
compensar el nivel
Puntas adhesivas artificiales - 3 puntas sobresalientes
Extremos adhesivos artificiales - extremos planos
Reemplazo de extremos adhesivos
Otras enzimas herramientas
ADN polimerasa
amplificación por PCR
la transcriptasa inversa
Construir biblioteca de ADNc
Polinucleótido quinasa T4
nucleasa S1
Preparación del gen diana.
gen objetivo
concepto
☞Un gen/fragmento de ADN específico que ha sido/debe ser aislado, transformado, amplificado y expresado, puede codificar un determinado producto/rasgo
También conocido como: gen especial o gen diana
fuente
Genoma de los cromosomas eucariotas (humanos y animales)
cromosomas procariotas
plásmido, virus
Mitocondrias, cloroplastos...
método
Método de descomposición directa
principio
ADN cromosómico → Endonucleasa de restricción: Cortar → Vincular todos los fragmentos → Un determinado vector → Transferir a E. coli → Propagar → Examinar con métodos apropiados → Colonias recombinantes que contienen el gen objetivo → Extraer ADN → Digestión enzimática → Obtener el gen objetivo.
objeto
Los genomas procarióticos son pequeños, los genes son fáciles de localizar o son moléculas de ADN con secuencias de nucleótidos conocidas.
ventaja
Rápido y sencillo, la pureza del producto es alta. gen objetivo
método de biblioteca de genes
principio
Toda la información genética del genoma de un determinado organismo → vector de clonación → almacenamiento: una subpoblación clonada de bacterias receptoras (la biblioteca del genoma de este organismo).
El grupo de bacterias receptoras que contiene todos los genes del genoma de un determinado organismo se denomina: biblioteca genómica del organismo.
síntesis química
Cuando se conoce la información de la secuencia, ¡es la forma más conveniente de obtener el gen objetivo!
método de amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
sustancia
Simulación in vitro de la replicación del ADN in vivo.
principio
ciclo
transexual
94 ℃
Calentamiento/alcalino, doble hebra de ADN → ruptura del enlace de hidrógeno → hebra simple
recocido
55 ℃
Renaturalización de plantilla y imprimación
extender
72 ℃
Secuencia DNS específica: crecimiento exponencial geométrico
Proceso de reacción de PCR/pasos de reacción
Desnaturalización del ADN molde.
Después de calentar el ADN molde a 94~95°C durante un cierto período de tiempo, el ADN bicatenario del ADN molde o el ADN bicatenario formado mediante amplificación por PCR se disocia en una sola hebra para que pueda unirse a el cebador y prepárese para la siguiente ronda de reacción;
Recocido (renaturalización) de ADN molde y cebadores.
Después de calentar y desnaturalizar el ADN molde en una sola cadena, la temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria de la cadena simple del ADN molde;
extensión de imprimación
Bajo la acción de la ADN polimerasa Taq, el conjugado plantilla-cebador de ADN utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo como plantilla. De acuerdo con los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa, se genera una nueva cadena de replicación semiconservativa complementaria. se sintetiza la cadena de ADN molde.
sistema de reacción de PCR
tampón de reacción
Sustrato: dNTP (4 tipos de desoxinucleótidos: dATP, dGTP, dTT, dCTP)
Imprimadores×2
Plantilla: molécula de ADN
Enzima Taq (ADN polimerasa)
Mg2 (cofactor enzimático)
Características de la PCR
alta sensibilidad
Fuerte especificidad
Sencillo, rápido y reproducible
Bajos requisitos de pureza de las muestras
transportador
El concepto de portador de genes.
Herramientas o portadores que introducen ADN extraño o genes diana en las células huésped apropiadas.
El transportista debe cumplir las condiciones.
La masa molecular relativa es pequeña y adecuada para recibir el gen diana;
Puede llevar a cabo una autorreplicación independiente y estable dentro de la célula huésped y aún puede mantener una replicación y características genéticas estables cuando se inserta ADN extraño.
Puede proporcionar marcadores seleccionables para las células huésped (receptores) y tener características fenotípicas identificables para una fácil detección;
Hay un único sitio de corte de endonucleasa de restricción apropiado en su secuencia de ADN. Este sitio está ubicado en la región no esencial para la replicación del ADN. Es decir, después de ser cortado por una determinada endonucleasa de restricción, el ADN plásmido se puede cerrar y abrir para admitir. materia extraña.Obtenga fragmentos de ADN sin perder sus propios fragmentos.
plásmido
concepto
Molécula de ADN de círculo cerrado de doble hélice
Es independiente de los cromosomas para la replicación y la herencia, y depende de enzimas y proteínas codificadas por el huésped para la replicación y la transcripción.
frente a los cromosomas
Todo lo relacionado con la genética biológica.
Químicamente diferente
Cromosomas: proteínas y ADN
Plásmido:ADN
tipo
tipo apretado
Sólo hay una copia, o como mucho hay unas pocas copias.
Relajado
Vectores de plásmidos comúnmente utilizados
Vector plasmídico de Escherichia coli
Dos genes de resistencia a los antibióticos
Operón lactosa: gen lacZ → β-galactosidasa → hidrólisis X-gal (detección de manchas blancas y azules de lacZ)
Extracción de ADN plásmido
extracción selectiva
En condiciones más suaves, se utiliza lisozima para lisar bacterias y los fragmentos celulares resultantes se separan mediante centrifugación de alta velocidad debido a las diferencias en el peso molecular relativo entre el ADN cromosómico y el ADN plasmídico. El ADN plasmídico con un peso molecular relativamente pequeño permanece en el sobrenadante y se precipita con etanol para obtener ADN plasmídico bruto.
Método SDS alcalino
Desnaturaliza selectivamente el ADN de doble hélice de cadena abierta en el cromosoma dentro del rango de pH de 12,0 a 12,5, mientras deja sin cambios el ADN de doble cadena de circuito cerrado. Después de la neutralización con acetato de sodio, el SDS hace que precipite el complejo proteína-SDS y el ADN con una masa molecular relativa alta, y luego el ADN plásmido se deja en el sobrenadante y se separa mediante centrifugación de alta velocidad.
Purificación de ADN plásmido
Centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa alcalina
El ADN cromosómico de doble hélice de cadena abierta se desnaturaliza fácilmente, mientras que el ADN plasmídico de doble cadena de círculo cerrado no se desnaturaliza fácilmente. En el gradiente de concentración de sacarosa, el ADN plasmídico se sedimenta más rápido que el ADN desnaturalizado y se separa y purifica.
Método de centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio (Et-Br)
El ADN de cadena abierta de la doble hélice del cromosoma se combina fácilmente con el colorante Et-Br y la densidad se reduce. El ADN plasmídico no es adecuado para la unión porque está muy cerrado. La densidad es alta y está separado. por centrifugación.
Método de adsorción por membrana de nitrocelulosa.
La membrana de nitrocelulosa adsorbe el ADN monocatenario y el ADN cromosómico se desnaturaliza fácilmente para formar ADN monocatenario, que se separa del ADN plásmido.
Transformar y construir
Eliminar áreas no esenciales
Agregar nuevos genes marcadores genéticos
Introducir secuencias de ADN con múltiples sitios de escisión y reconocimiento de enzimas de restricción, es decir, múltiples sitios de clonación.
fago lambda
fago
No puede reproducirse independientemente de las células huésped y sólo puede crecer en células vivas y es estrictamente específico de las células huésped.
Tipos principales
insertar vector
vector de reemplazo
Otros transportistas
Recombinación genética
concepto
Gen diana y vector: combinación in vitro → recombinante.
Método de reorganización
Extremos principalmente pegajosos
unión directa
Sencillo y eficiente
Agregar unión de cola
Uso de nucleotidil transferasa terminal para crear extremos pegajosos en los extremos del ADN
Enzima herramienta principal: T4-DNA ligasa (5'-P y 3'-OH)
recombinación de ADN
① Ligadura de extremos pegajosos producida por la misma endonucleasa
② Ligadura de extremos pegajosos producida por enzimas homocigotas.
③Conexión de diferentes extremos adhesivos
④Conexión de extremos adhesivos artificiales (extremo sobresaliente de 5', extremo sobresaliente de 3', extremo plano)
⑤ Reemplazo del extremo adhesivo
Tasa de recombinación = índice de componentes de recombinación que contienen ADN exógeno / número de moléculas de vector, condiciones experimentales de rutina: 25 ~ 75 %
Transformación y expresión genética
El gen objetivo se introduce en las células receptoras.
célula huésped (célula receptora)
concepto
Células que reciben ADN de genes extraños durante la transformación, transducción e hibridación.
es lugar de amplificación recombinante
tipo
células procariotas
Escherichia coli, Bacillus subtilis
células eucariotas
Levadura (principalmente)
Características
Unicelular
No patógeno, seguro
Competencia
Competencia
Las células huésped pueden absorber moléculas de ADN exógenas y actuar eficazmente como receptores de transformación en ciertos estados fisiológicos.
Dependiendo de
El estado fisiológico de la propia célula receptora.
Configuración y tamaño de moléculas de ADN recombinante.
Células huésped generales en fase de crecimiento logarítmico: capacidad de transformación Max
células competentes
Células en estado fisiológico que pueden absorber moléculas de ADN externas.
Convertir
Transformación inducida por Ca2 de células bacterianas intactas.
transformación de electroporación
Tasa de conversión
concepto
Factores de influencia
cribado de amplificación
amplificar
Método de detección
Detección basada en genes de resistencia a antibióticos de vectores y medicamentos seleccionados correspondientes
Método de cribado para transformar Escherichia coli con un vector plásmido que porta marcadores dobles de resistencia a antibióticos
Portador: Amp (resistente a ampicilina), Tet (resistente a tetraciclina)
Se inserta un gen extraño en uno de los genes de resistencia a los antibióticos provocando su inactivación.
Dos placas de antibióticos para detectar recombinantes
paso
①Selección positiva
Contiene antibióticos correspondientes a genes de resistencia inactivados no insertados.
Transformante√
Transformante que contiene plásmido que contiene gen diana √
Transformante que contiene gen diana recombinante √
No transformante ×
②Selección negativa
Antibióticos que contienen genes de resistencia inactivados por inserción.
Transformantes no recombinantes que no contienen el gen diana√
Transformantes que contienen recombinantes de genes diana ×
Comparación de los dos medios → Selección: Transformantes que contienen recombinantes del gen diana
Detección utilizando el gen lacZ del operón de la lactosa (mancha azul-blanca)
Las bacterias con un operón de lactosa completo pueden traducir el gen LacZ que codifica la β-galactosidasa → hidrolizar X-gal → azul
Inserción de gen extraño → El gen LacZ no se puede expresar → blanco
Requerido: No se ha insertado ningún gen de resistencia a antibióticos inactivado → medio de cultivo de ampicilina
Transformante que contiene plásmido que contiene gen diana: cepa azul
Transformante que contiene gen diana recombinante: cepa blanca
Aplicación de chip de ADN para identificar recombinantes
Muchos oligonucleótidos de ADN/fragmentos de ADN (sondas) específicos → fijos: posición preestablecida del chip
Muestra a analizar: etiquetar → hibridar con chip (principio de emparejamiento de bases complementarias) → detectar señal de hibridación y análisis por computadora
Cribado basado en productos de traducción de genes diana (proteínas, enzimas, polipéptidos) [Sin gen marcador o no se puede sintetizar la sonda]
electroforesis en gel de proteínas
PÁGINA
inmunoensayo
ELISA
transferencia Western
Inmunoprecipitación
radioinmunoensayo en fase sólida
Expresión del gen diana.
Aplicaciones en la industria alimentaria: alimentos genéticamente modificados
alimentos microbianos genéticamente modificados
definición
Bacterias de ingeniería
Características
solicitud
(1) Mejorar la calidad de los productos alimenticios.
(2) Simplificar el proceso de producción y acortar el ciclo de producción.
(3) Conservación antibacteriana y antiséptica de los alimentos.
(4) Mejora de las bacterias productoras de enzimas de calidad alimentaria.
(5) Producción de ingredientes funcionales para alimentos saludables.
(6) Detección rápida de microorganismos alimentarios.
alimentos para animales genéticamente modificados
Tipos involucrados
aplicación principal
Cambiar la tasa de reproducción del ganado;
Mejorar la composición nutricional de los productos lácteos, especialmente para lactantes y niños pequeños.
Producción de proteínas séricas humanas, etc. mediante biorreactores.
alimentos vegetales genéticamente modificados
definición
tipo
solicitud
Mejorar la calidad de los ingredientes alimentarios.
Mejorar los procesos de producción de alimentos.
Producción de aditivos alimentarios y alimentos funcionales.