Reconocer secuencias específicas de 4-8 pares de bases en moléculas de ADN de doble cadena.

Los sitios de escisión de la mayoría de las enzimas se encuentran dentro o en ambos lados de la secuencia de reconocimiento.

Identificar la secuencia de escisión como una estructura palíndromo rotacionalmente simétrica clásica.

Divide el ADN para producir extremos que contienen grupos 5' fosfato y 3' hidroxilo.

Los cortes desplazados producen extremos pegajosos, los cortes a lo largo del eje de simetría producen extremos planos

La mayoría de las enzimas de tipo II requieren condiciones de reacción similares.

Hidrólisis enzimática combinada multienzimática.

Impurezas: proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, NaC, etc.

Acercarse

Ciertas endonucleasas de restricción requieren muchas veces más enzima para escindir el ADN plasmídico o el ADN viral superenrollado que para digerir el ADN lineal.

Algunas endonucleasas de restricción de ácidos nucleicos cortan los sitios de las enzimas de restricción en diferentes posiciones y su eficiencia también es significativamente diferente.

Actividad ADN polimerasa 5'->3'

Actividad exonucleasa 5'->3'

Actividad exonucleasa 3'->5'

Traducción de Nick: Las actividades exonucleasa y polimerasa 5'->3' trabajan juntas para hacer avanzar el mella.

Preparación de sondas de ADN marcadas con 32P.

Fuente: La ADN polimerasa Ⅰ de Escherichia coli se trata con subtilisina para obtener el tercio N-terminal del segmento peptídico grande, que es la enzima Klenow.

Tiene actividad ADN polimerasa 5'->3' Tiene actividad exonucleasa 3'->5' Pérdida de actividad exonucleasa 5'->3'

1||| Rellena los extremos pegajosos de 5' generados por endonucleasas.

2||| Marcado isotópico de extremos de fragmentos de ADN.

3||| Síntesis de la segunda cadena de ADNc

4||| Determinación de la secuencia de ADN mediante el método de terminación del extremo de la cadena didesoxi.

① Actividad ADN polimerasa 5'->3' ② Actividad de la polimerasa exonucleolítica 3'->5' ③ Falta de actividad exonucleasa 5'->3' ④ En ausencia de dNTP, la exoescisión se puede realizar desde cualquier extremo 3'-OH ⑤ Cuando solo hay un tipo de dNTP, la exólisis se detiene cuando se expone el nucleótido complementario. ⑥ Cuando los cuatro dNTP están presentes, domina la actividad de polimerización.

①Corte el extremo adhesivo 3' generado por la endonucleasa

② Marcado isotópico de extremos de fragmentos de ADN.

① Actividad ADN polimerasa 5'->3' ② Actividad exonucleasa 3'->5' ③ Tiene la procesividad más fuerte entre las ADN polimerasas conocidas. ④ Después de la modificación, se convierte en una enzima de secuenciación para fragmentos largos de ADN utilizando el método de terminación de cadena didesoxi.

Reacciones de extensión de cebadores para fragmentos de ADN más largos.

Etiquetado final rápido mediante reacciones de llenado o intercambio (desplazamiento)

Fuente: timo de ternera

La ADN polimerasa sin plantilla incorpora aleatoriamente dTNP en el extremo 3'-OH

Agregue colas de homopolímero complementarias al vector o al ADN objetivo

Marcado isotópico de extremos 3 'de fragmentos de ADN.

(1) síntesis de ADNc guiada por ARN

(2) Escisión bidireccional de la cadena de ARN en la cadena híbrida de ADN-ARN (actividad RNasa H)

(3) Actividad de polimerización de ADN guiada por ADN.

AMV: una enzima transcriptasa inversa derivada del virus del mieloblastoma aviar purificado (funciona a 42°C)

MMLV: producto de expresión del gen de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) en E. coli (funciona a 37 °C)

Transcribir el ARN de genes eucariotas en ADN y construir una biblioteca de ADNc

Evalúe y etiquete el extremo 3' de los fragmentos de ADN con salientes 5' y prepare sondas.

Reemplaza el fragmento de Klenow para la secuenciación de ADN

Elimine el grupo fosfato del extremo 5' del ADN del vector para evitar que el vector se cicle y mejore la tasa de recombinación.

Elimine los grupos 5' fosfato del ADN y el ARN y luego etiquételos con polinucleótido quinasa T4.

① Endocución de ADN o ARN monocatenario

② ADN o ARN bicatenario con mellas o hendiduras en su interior

① Retire el saliente monocatenario del fragmento de ADN y conviértalo en un extremo romo. ② Eliminar la estructura en horquilla formada durante la síntesis de ADNc ③ Analizar la cantidad de ARNm mediante el experimento de protección de la nucleasa S1 ④ La hibridación de ARNm maduro y ADN genómico, combinada con la hidrólisis por esta enzima, puede localizar intrones. ⑤ Recortar los extremos de las mutaciones de eliminación progresiva.