Ф с Основные гены циркадных часов (гены CC): ни диета, ни микробный статус кишечника не влияют на циркадную ритмику и амплитуду основных генов CC в соскобах слизистой оболочки.

Уровни транскриптов антимикробных пептидов: у мышей rc-SPF наблюдались значительно повышенные уровни транскриптов в определенных ZT, особенно у членов семейства REG3, включая Reg3g и Reg3b, без существенных различий в других, таких как LYZ1.

Уровень трансляции: (Метод: Иммуноокрашивание): Аналогичный паттерн суточных вариаций REG3g наблюдался в группе rc-SPF, но не в группе SPF-hf, хотя не было очевидной разницы в уровнях экспрессии или уровнях колебаний при иммуноокрашивании LYZ1.

Методы: вестерн-блоттинг: обнаружены колебания REG3γ, зависящие от диеты и zt (времени).

Только мыши 1-8, получавшие RC, демонстрировали ZT-зависимую экспрессию Reg3g, тогда как не было различий в экспрессии ZT2 и 10 в криптах у мышей, получавших RC или HF (рис. 1F).

1. Независимо от микробного статуса или диеты, основная генная сеть CC стабильна; 2. Циркадные ритмы экспрессии Reg3g хозяина в ворсинчатых эпителиальных клетках определяются присутствием кишечных микробов, включая микробы, выбранные с пищей.

HF значительно увеличивал относительную численность видов, принадлежащих к типу Firmicutes, и уменьшал тип Bacteroidetes. Методы: ампликонное секвенирование гена 16SrRNA и количественный анализ микробной экологии (QIIME) регулярно проводили на содержимом дистального отдела подвздошной кишки.

Анализ бета-разнообразия с использованием Брея-Кертиса выявил значительные различия между микробными сообществами RC и HF (таблица S3).

Хотя число копий гена 16SrRNA показало схожие амплитуды у мышей, получавших RC и HF, HF индуцировал фазовый сдвиг относительно RC (рис. 2C).

Значительные различия OTU наблюдались между мышами, получавшими RC и HF (рис. 2D), при этом HF значительно увеличивал количество Clostridiales и уменьшал количество Bacteroidetes по сравнению с RC (таблица S2).

Процент колеблющихся и неколеблющихся OTU, определенных eJTK (круговая диаграмма), а также количество уникальных и общих колеблющихся OTU (диаграмма Венна). 15% таксонов подвздошной кишки колебались при RC и были значительно уменьшены при HF. В общей сложности 81 уникальный осциллирующий OTU наблюдался в содержимом просвета мышей, получавших RC, тогда как 14 уникальных OTU присутствовали у мышей, получавших HF; только два осциллирующих OTU перекрывались в RC и HF (таблица S4).

В условиях HF колебания, аннотированные к родам, отсутствовали, общая численность уменьшалась или теряла колебания по сравнению с OTU RC (рис. 2F).

1. HF существенно изменяет микробное богатство дистального отдела подвздошной кишки. 2. HF выбрал группу групп колебаний, которые относительно уникальны для RC. 3. Несмотря на общее снижение ОТУ ВЧ колебаний

Результаты корреляционного анализа Пирсона показали, что только 3 OTU в содержимом просвета мышей, получавших RC и hf, значимо коррелировали с экспрессией Reg3γ. Между экспрессией OTU Lactobacillus и Reg3g наблюдалась положительная корреляция, тогда как экспрессия OTU семейств Clostridiaceae и Peptidetococcaceae коррелировала отрицательно (рис. 2G).

Хотя OTU, отрицательно коррелирующие с Reg3g, не колебались у мышей, получавших RC или HF, их относительное содержание было значительно увеличено во всех ZT по сравнению с RC (рис. 2H).

Относительная численность Clostridiaceae, Lactobacilliaceae и Gastrostreptococcus показала почти одинаковые положительные и отрицательные корреляции с экспрессией Reg3g (рис. 2I).

1. Lactobacilliaceae обогащены RC и демонстрируют колебания 2. Специфические OTU молочнокислых бактерий положительно коррелируют с ежедневной экспрессией Reg3g хозяина. 3. Кормление HF снижает микробную колеблемость и способствует общему распространению Clostridiaceae и Gastrostreptococcus, оба из которых отрицательно коррелируют с экспрессией Reg3g.

При ZT10, по сравнению с лизатом HF, воздействие лизата в просвете подвздошной кишки мышей SPF в течение 24 часов индуцировало экспрессию Reg3g в энтероидных клетках мышей WT.

Метод: в качестве кондиционированной среды использовали Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, семейство Lactobacilliaceae), анаэробный желудочный стрептококк (clostridiaceae P. stomatis) и орогастральные анаэробы (LGG, семейство Orogastric Streptococcus). Результаты: Воздействие энтероидов на среду, кондиционированную LGG, в течение 12 часов значительно индуцировало экспрессию Reg3γ (рис. 3B).

Мы заметили, что LGG сам по себе индуцировал экспрессию Reg3g, тогда как P. stomatis сам по себе этого не делал. Совместное воздействие Enterobacteriaceae ингибировало индукцию Reg3g даже в присутствии LGG. Эти данные указывают на то, что бактерии, отобранные с помощью HF, оказывают ингибирующее действие на экспрессию Reg3g независимо от воздействия индукционно-кондиционированной среды.

Цель: определить, требуется ли LGG или P. stomatis передача сигналов MyD88 для воздействия на экспрессию Reg3g (источник). Методы: Кишечники SPFMyD88/или MyD88/однопометников подвергались воздействию различных бактериальных кондиционированных сред. Результаты: LGG значимо индуцировал Reg3g в MyD88/-, но не в MyD88-/-, в парах P. stomatis индукция не наблюдалась независимо от статуса MyD88 (рис. 3D); Вывод: LGG нужен MyD88

Цель: Чтобы дополнительно выяснить, влияют ли малые молекулы, полученные из LGG или P. stomatis, дифференциально на экспрессию Reg3g, Методы: Кондиционированные среды были фракционированы по размеру (рис. 3E). Результаты: Малых молекул массой менее 3 кДа, полученных из LGG, было достаточно, чтобы индуцировать экспрессию Reg3g, тогда как P. stomatis оказывал значительный ингибирующий эффект на все компоненты, содержащие небольшие молекулы массой менее 30 кДа. Вывод: небольшие молекулы, полученные из LGG, индуцируют Reg3g, тогда как небольшие молекулы, полученные из P. stomatis, ингибируют экспрессию Reg3g myd88-зависимым образом.

Цель и методы: проверить, влияет ли термическая обработка фракции кондиционированной среды Igg массой 3 кДа на ее способность индуцировать экспрессию Reg3g. Результаты: В энтероидных клетках мышей SPF-WT термическая обработка привела к снижению способности индуцировать Reg3g на 30-40% по сравнению с необработанным изолированным LGG 3 кДа (рис. 3F).

1. Маленькие молекулы, полученные из LGG, термически нестабильны. 2. Для индукции Reg3g могут потребоваться штаммоспецифичные соединения.

подтема

Чтобы дополнительно охарактеризовать и дифференцировать уникальные небольшие молекулы, продуцируемые LGG и L. reuteri, мы затем провели масс-спектрометрический анализ с помощью ЖХ-МС/МС при 3 кДа и термообработанных кондиционированных средах (рис. 3G). Lactobacillus reuteri 3 кДа демонстрирует уникальные характеристики по сравнению как с необработанным, так и с термически обработанным 3 кДа LGG.

Анализ различий и кратных изменений (FC) (p1) показал: 859 уникальных различий в малых молекулах между необработанным и термообработанным LGG с молекулярной массой 3 кДа и L. reuteri с молекулярной массой 3 кДа показали 1439 уникальных различных свойств с перекрытием 149 (рис. 3H); ).

График вулкана показал снижение содержания малых молекул между необработанным LGG 3 кДа и термически обработанным LGG (7,51–6,88), в то время как LGG 3 кДа показал больший FC (10,69–9,88) по сравнению с 3 кДа L. reuteri (рис. 3I). Это говорит о том, что различия в профилях малых молекул между LGG и L. reuteri больше, чем те, которые наблюдаются после термической обработки LGG.

Топ-25 дифференциально распространенных молекул с самым высоким положительным и отрицательным содержанием fc по сравнению с LGG3kDa показаны в Таблице S5. Хотя идентичность многих метаболитов неизвестна, некоторые из них были идентифицированы как аминокислоты с разветвленной цепью (таблица S5, выделена синим цветом). А

Хотя в настоящее время неясно, какие именно небольшие молекулы вызывают индукцию или репрессию экспрессии Reg3g, эти данные позволяют предположить, что существуют значительные различия в профиле экспрессии Reg3g у каждой бактерии.

Чтобы интерпретировать наши результаты in vitro, мы ассоциировали мышей RCfed-GF со штаммами молочной кислоты, которые обладают уникальной способностью индуцировать экспрессию Reg3g, и штаммами, которые уникально устойчивы к антимикробным свойствам REg3g, а именно LGG и Lactobacillus reuteri (рис. 3J). . Экспрессия Reg3g была значительно увеличена только в ссадинах слизистой оболочки подвздошной кишки у LGG-моноассоциированных мышей, собранных на уровне ZT10 (ожидаемый пик экспрессии), но не у контрольных GF или моноассоциированных с L. reuteri мышей. Только LGG-моноассоциированные мыши демонстрировали колебания Reg3g, тогда как низкие и постоянные уровни экспрессии наблюдались у GF и L. reuteri-моноассоциированных мышей во всех 3 zt.

Дополнительные материалы: LGG-моноассоциированным мышам и их аналогам GF давали RC или HF соответственно. LGG-HF привел к скромному, но значительному увеличению веса по сравнению с LGG-RC через 3 и 4 недели после ассоциации (рис. S3E).

Состав диеты и специфические бактерии напрямую влияют на Reg3g в дистальном отделе подвздошной кишки в течение дня, что соответствует изменениям метаболических результатов хозяина.

Диета или генетический фон не влияли на общую и ежедневную экспрессию CC, что дополнительно подтверждает независимость между основной генной сетью CC и Reg3g (рис. S4A; таблица S1).

В RCReg3g/мышь экспрессия Reg3g была значительно повышена и увеличивалась день ото дня, достигая пика на ZT10, тогда как в Reg3g/мышь транскрипт не был обнаружен (рис. 4А).

Reg3g и другие AMP не зависят от основного CC, а Reg3g, по-видимому, опосредует влияние диеты на экспрессию и ритмичность Muc2.

Мыши Reg3g -/- были одинаково восприимчивы к ожирению, вызванному диетой HF, по сравнению с Reg3g/однопометниками, демонстрируя увеличение массы тела на 12% за 4 недели по сравнению с мышами, получавшими RC (рис. 4B).

1. По сравнению с контрольными мышами, получавшими rc-кормление Reg3g/-, мыши, получавшие rc-кормление Reg3g-/, демонстрировали значительно худшую толерантность к глюкозе, более медленный клиренс глюкозы и увеличение площади под кривой (AUC). 2. Скорость клиренса глюкозы в крови при HF была снижена, независимо от того, чем получал RC Reg3g/мышь (рис. 4C).

Дополнительные материалы: Независимо от генотипа HF значительно увеличил относительную численность Firmicutes с соответствующим уменьшением численности Bacteroidetes и небольшим изменением численности Actinobacteria (рис. S5A).

Анализ бета-разнообразия с использованием расстояния Брея-Кертиса показал, что членство в сообществе HF менялось независимо от генотипа содержимого просвета (рис. 5A; таблица S3).

Значительные различия в членстве в сообществе наблюдались между генотипами, но только при кормлении RC, что указывает на зависимый от диеты эффект генотипа (рис. 5B, левая панель), который устранялся HF (рис. 5B, правая панель).

Относительная численность Lactobacilliaceae была снижена у мышей Reg3g/, получавших hf, ​​по сравнению с мышами Reg3g/, получавших RC, тогда как у мышей, получавших RC, присутствие Peptidococcaceae и Clostridiaceae почти во всех ZT было снижено независимо от генотипа (рис. 5C). .

Диета активно реконструирует микробиом дистального отдела подвздошной кишки с умеренным и зависимым от диеты действием REG3g.

Хотя количество копий гена 16SrRNA не различалось между группами, циркадная ритмичность была очевидна только у мышей, получавших rc-кормление reg3g-/ (рис. S5D; таблица S1).

По сравнению со всеми другими таксонами, колебательные таксоны имели наибольшее разнообразие на порядковом уровне внутрипросветного содержимого (рис. 6А, левая панель; таблица S6). У мышей Reg3g HF приводил к снижению количества колеблющихся лактобацилл и клостридий по сравнению с контрольной группой, получавшей RC-питание. Однако у Reg3g/мышь HF уменьшал осциллирующие порядки Bacteroidetes, одновременно увеличивая осциллирующие Clostridiales (рис. 6A, левая панель; таблица S6). Мы заметили, что царапины на слизистой оболочке проявляют уникальные колебательные свойства OTU по отношению к содержимому просвета (рис. 6A, правая панель; таблица S6). Независимо от генотипа, колебательные OTU RC были гораздо менее разнообразны по сравнению с их внутрипросветным содержимым (рис. 6a; таблица S6).

Многие колеблющиеся Lactobacillus OTU показали повышенную относительную численность у мышей, получавших RC, независимо от генотипа (рис. 6B).