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心智圖資源庫 毒理學4毒理學實驗基礎
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毒理學4毒理學實驗基礎
此圖介紹了毒理學實驗的原則與限制、毒理學實驗的基本目的、實驗動物的選擇與管理、動物實驗方法、毒理學實驗結果的統計分析、毒理學實驗的品質控制，希望對大家有幫助！
編輯於2024-02-18 11:49:24
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毒理學4毒理學實驗基礎
課後複習題
1.動物實驗結果外推到人不確定性的原因有哪些？
2.毒理學試驗設計應遵守哪些基本原則？
3.判斷實驗結果是否有生物學意義應該考慮哪些問題？
毒理學實驗種類及目的有哪些？
體外實驗
篩選、預測毒性、探討機制
體內實驗
評估毒性：動物→人
人群研究
動物實驗結果的驗證
一、毒理學實驗的原則與局限性
一、毒理學實驗的基本原則
1.對實驗動物產生的作用可以外推到人
①最敏感的動物物種是人。
②人、實驗動物的生物過程及化學物代謝與體重或體表面積相關。
以上兩個假設是全部實驗生物學、醫學的前提。
2.實驗動物必須暴露於高劑量
依據質反應定義，群體效應發生率隨暴露程度升高而增加。
設3個或以上劑量組，觀察劑量-反應關係。
LOAEL與人的暴露劑量距離越大越安全。
3.實驗對象為成年健康的動物
成年健康動物作為普通人群的代表性實驗模型，可使實驗結果具有代表性和可重複性。
4.染毒途徑為人可能的暴露途徑
二、毒理學實驗的局限性
從動物實驗外推到人有不確定性
高劑量向低劑量外推有不確定性
少量動物到大量人群外推有不確定性
通常選用成年健康動物，反應較單一
三、動物實驗的「3R」原則及倫理學
「3R」原則
替代(replacement)
用其他方法而不用動物進行的實驗或其他研究達到某一實驗目的，或使用沒有知覺的實驗材料代替使用神誌清醒的脊椎動物進行實驗的一種科學方法。
減少(reduction)
用較少動物得到同樣多的實驗數據或用一定數量動物得到較多實驗數據的方法。
優化(refinement)
經改進和完善實驗程序，減輕或減少動物疼痛和不安，提供動物福利的方法。
動物實驗的倫理學問題
法律
《馬丁法案》、《實驗動物管理條例》
遵守原則
給予實驗動物人道主義的管理和處理；使實驗動物痛覺和不適感減少至最低；避免不必要的使用實驗動物。
人體實驗的倫理原則
知情同意原則
有利無傷原則
醫學目的原則
科學性原則
實驗對照原則
二、毒理學實驗基本目的
安全性評估的基本目的
觀察受試物的毒作用表現和性質
劑量-反應（效應）關係研究
確定毒作用標靶器官
確定損害的可逆性
毒理學實驗的其他目的
毒效應的敏感檢測指標
生物學標誌
中毒機制
受試物的毒物動力學
受試物的代謝、中毒解救措施
三、實驗動物的選擇與管理
實驗動物（laboratory animal）
經人工培育的，對其所攜帶的微生物實行控制的，遺傳背景明確、來源清楚的動物。主要用於科學研究、藥品、生物製品的效用與安全性評估及教學等。
實驗動物物種的選擇
常規選兩個物種：囓齒類和非囓齒類
基本原則
①代謝、生化及毒理學特徵上與人類相近
②自然壽命較短
③易於管理和操作
④經濟、易得
實驗動物品系的選擇
品系：實驗動物學的專有名詞，指經計畫交配法，得到同一祖先的一群動物，或來自同一祖先且有特定基因型的動植物或微生物。
實驗動物依遺傳學控制分類
近親交配系
全同胞兄妹或親子之間連續交配二十代以上而培育的純品系動物。如小鼠有BALB/C，津白Ⅰ，津白Ⅱ等。
雜交群類（雜交1代，F1）
兩個不同的近交系之間有目的進行交配而產生的第一代動物。有明確的遺傳性和雜交優勢。
封閉群
一個族群在5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。如昆明小鼠、NIH小鼠、Wistar大鼠等。毒理學研究中使用最多。
實驗動物的微生物控制參數
普通動物（Conventional Animal, CVA）
清潔動物（Clean Animal, CLA）
在毒性試驗及毒理學研究中，為確保實驗結果的可靠性，應使用CLA或以上動物。
無特定病原體動物（Specific Pathogen-free Animal, SPF）
無菌動物（Germ free Animal, GFA）
實驗動物微生物等級標準
I 級：CVA，開放系統，無傳染給人的傳染病。
等級 II：CLA，屏障系統，除 I 級標準外，種係清楚，無該動物特有的傳染病。
三級：SPF，屏障或隔離系統，除 II 級標準外，依純係要求繁殖，飼養在隔離器或層流室內，可有不致病性細菌叢，無致病病原體。
四級：GFA，隔離系統，在全封閉無菌條件下飼養的純係動物，動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲（包括絕大部分病毒）。
實驗動物的個體選擇
性別
年齡和體重
生理狀態
健康狀況
實驗動物設施構成
動物接收、檢疫區
動物飼養、實驗區
飼料、墊料及備品存放區
洗刷、消毒區
廢棄物保管、處理區
管理區
實驗動物設施種類
開放系統（open system）: 普通環境
屏蔽系統（barrier system）: 萬級清潔度
隔離系統（isolation system）: 百級清潔度
四、動物實驗方法
動物實驗設計原則
隨機化原則
完全隨機（單因子設計）
分層隨機（配伍設計）
對照原則
毒理學試驗常用對照
未處理對照（空白對照）
無處理因素、無受試物、無操作
確定生物學特徵的本底值，品管
陰性對照（溶劑對照）
無處理因素，給予必需的實驗因素（溶劑），排除實驗因素（溶劑）的影響。
陽性對照
用已知陽性物檢測實驗體系的有效性。
遺傳毒理學試驗、致畸試驗、致癌試驗都設陽性對照組。
自身對照
同一研究對象自身處理前後互為對照。如觀察服藥前後血壓的變化。
要求研究因素處理前後的實驗條件一致，觀察參數穩定。
歷史對照
由同一實驗室過去多次實驗的對照組數據所構成。
透過同質性檢驗來檢查實驗系統的穩定性，控制和保證實驗室品質。
重複原則
整個實驗的重複
確保實驗結果的重現性。
多個受試對象的重複觀察
每組要有足夠的樣本數。
動物實驗設計要點
體內毒理學試驗的劑量分組
各組動物數
試驗期限
動物實驗前的準備
實驗動物購後，應雌雄分開飼養
一般進行5~7天的檢疫
常用實驗動物性別鑑定
染毒前的準備
動物分組
稱重、編號、隨機分組
受試物的準備
劑量分組、染毒容積、稀釋
染毒途徑選擇
胃腸道、呼吸道、皮膚、皮下、皮內、肌肉、腹腔、靜脈
受試物準備
染毒製劑
常用劑型：水溶液、混懸液、油溶液
水溶性受試物保持與體內滲透壓一致
非水溶性受試物，溶於或懸浮於適當的有機溶劑中
受試物一般應臨用前新配
準備染毒製劑的要點
準備時，加熱受試物不要接近改變其理化性質的溫度
評估固體受試物皮膚毒性，要保持其形狀、顆粒大小
依配方配製多成分受試物，使製劑準確反映原混合物
製劑應保持化學穩定性和受試物的一致性
製劑應降低總試驗容積，以溶劑或賦形劑量不要過多
製劑要容易準備染毒
製劑pH最好是5~9
不要用酸或鹼使受試物解離
非胃腸道染毒，終溶液盡量等滲
實驗動物的染毒途徑
經口（胃腸道）染毒
吞嚥膠囊
餵食
灌胃
經呼吸道染毒
研究生產條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在的化學毒物及評估環境空氣污染物
吸入染毒：靜式和動式
氣管內注入：麻醉後進行
經皮膚染毒
液態、氣態甚至粉塵狀態的化學毒物
多選擇家兔和豚鼠，採用動物脊柱兩側皮膚脫毛，局部塗敷受試化學毒物並以玻璃鐘罩、油紙或塑膠薄膜覆蓋固定一定的時間。
農藥、化妝品、環境污染物、外用藥物
常用大鼠
染毒方式
除毛：化學或機械法除毛
染毒：局部塗抹或浸尾法
經注射途徑染毒
腹腔注射
靜脈注射
肌肉內注射
皮下注射
生物標本採集
尿、糞便採集
髒器標本採集
膽汁採集
血液收集
終末
非終末採血
單次採血量小於動物總血量15%，不會有影響動物
取血量是總血量的15%~20%時會產生副作用
多次採血每24小時不應大於總血量的1%
麻醉
全身（戊巴比妥鈉）和局部麻醉（普魯卡因等）
安樂死
以大眾認同、符合人道方法處死動物的過程，使其無驚恐、焦慮而安靜、無痛苦地死亡
病理解剖和標本留取
病理學檢查是毒理學試驗的重要組成部分，病理學研究可幫助判斷有害作用和目標器官。病理學檢查包括大體解剖和組織病理學檢查。
大體解剖
在實驗動物處死後半小時內以胸腔、腹腔臟器合併取出法解剖。
觀察有關臟器的外形和表面狀況、顏色、邊界、大小、質地、切面。
對指定的髒器進行稱重，計算臟器係數。
實驗動物病理解剖標準操作程序
1.固定動物在解剖板上，解剖頸部（腮腺、淋巴結等）
2.取一側乳房及腰部皮膚，開腹並擴展切口（腹內臟器）
3.開胸（胸內臟器，舌喉，氣管，甲狀腺等）
4.剝離左後肢（肌肉等），頭皮、耳，開顱，暴露脊髓
組織病理學檢查
用鋒利的刀剪取材指定的器官或組織，統一取材部位。
組織塊通常在10倍體積的10%甲醛液中固定，然後常規製片（組織石蠟包埋、切片、HE染色）。
顯微鏡下觀察並記錄，作出病理診斷。
五、毒理學實驗結果的統計分析
結果的統計分析
各處理組與陰性對照組兩兩比較及多個處理組與陰性對照組比較
劑量-效應關係與劑量-反應關係
品質管制圖
評估毒理學試驗結果必須回答的問題
是否有統計學意義
是否有生物學意義
是否有毒理意義，即是否有害效應
判斷生物學意義考量的問題
縱向比較：此參數改變是否有劑量-反應關係。
橫向比較：此參數的改變是否伴隨其他相關指標變化。
處理組與對照組均數的差值大於檢測誤差兩倍以上。
判斷生物學意義考量的問題
與歷史性對照比較：實驗動物參考正常值由本實驗室以相同品系實驗動物和相同的溶劑，最近進行至少10次獨立實驗的陰性對照的結果構成，以其均值±1.96×標準誤作為參考值範圍。陰性對照應在歷史性對照的均數±3×標準誤範圍內。
處理組某種觀察值與對照組比較，差異有統計學意義，並符合下列情況之一者，即可認為已超出正常參考值範圍，屬於有害作用。
①其數值超出正常參考值範圍
②其數值在正常參考值範圍內，但停止接觸後，此差異仍持續一段時間
③其數值在正常參考值範圍內，但若機體處於功能或生化壓力狀態下，差異更加明顯。
毒理學試驗結果的統計意義與生物學意義
六、毒理學實驗的品質控制
優良實驗室規格(good laboratory practice, GLP)
是針對藥品、食品添加物、農藥、化妝品和其他醫用物品的毒性評估製訂的管理法規。
是一種法規文件，用於規範與人類健康、環境有關的非臨床安全性研究的一整套組織管理體系，包括實驗計劃、實施、監督、記錄、檔案管理。
國內外GLP的發展史
已開發國家在二十世紀六、七十年代即開始正式發展實施GLP。
目前已實施GLP制度的有美、日、英、德、荷蘭、瑞典和瑞士等國家。
我國在二十世紀八十年代末相繼開展了藥品和其他相關產品、毒物的GLP研究和實施工作。
目的和意義
旨在組織、管理科技人員的研究行為
促進科學研究者提高實驗數據的品質和有效性
促進國際間實驗數據的互相認可
避免不必要的實驗重複，減少資源浪費
保障實驗結果的可靠性、完整性和可重複性
基本內容
對組織機構和人員的要求
實驗設施,儀器設備及實驗材料的要求
標準作業規程(SOP)
對研究工作實施過程的要求
對檔案及其管理工作的要求
實驗室資格認證及監督檢查
標準操作規程（SOP-Standard Operation Procedures）
目的是保證操作重現性和結果可信性
接受過教育及訓練人員依SOP進行試驗時，其試驗操作及操作結果的重現性較好
同一研究機構或實驗室內，由不同人依SOP進行操作與試驗，可確保達到較一致結果
組織體系
品質保證部門（QAU—Quality Assurance Unit）
QAU指檢驗機構內負責保證其各項工作符合GLP規範要求的部門或組織。
QAU是GLP建設的關鍵。有了良好的實驗方案和各種具體操作的SOP，並不一定能保證有高品質的試驗結果。
專案負責人（SD-Study Director）
指負責組織實施某項研究或檢驗工作的人員。 SD是檢驗機構中具體組織管理的核心人物。具備廣博知識結構，豐富工作經驗。 SD的培養和素質對GLP實驗室至關重要。
毒理學實驗設計的品質控制
體內毒理學實驗設計要點
體內毒理學試驗的劑量分組
各組動物數
試驗期限
體外毒理學試驗設計
測試受試物溶解性
試驗最高劑量的建議（10mmol/L 或 5mg/ml）
代謝活化（多氯聯苯1254預處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液（S9）及NADPH再生系統）
毒理學實驗實施過程中的品質控制
實驗室操作規程及管理
試劑管理
儀器管理
環境管理
實驗動物管理
盲法管理
品質管制圖
毒理學實驗結果分析的品質控制
實驗數據統計分析
實驗結果評價
思考題
由於慢性毒性試驗週期長，動物消耗大，需要投入大量的人力和物力，如何保障慢性動物試驗的可靠性？
實驗室品質控制是保障試驗成功、實驗數據的科學性和準確性的先決條件。
慢性毒性試驗應遵循良好實驗室規範（GLP）進行管理。
包括試驗設計合理、動物選擇與管理、受試物的配製與管理、試驗操作、檢測條件的控制。