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マインドマップギャラリー 遺伝子工学
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遺伝子工学
これは遺伝子工学に関するマインド マップであり、詳細な紹介と包括的な説明が含まれており、興味のある友人に役立つことを願っています。
2023-11-24 01:34:49 に編集されました
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遺伝子工学
遺伝子
コンセプト
DNA分子に遺伝的影響を与える特定のヌクレオチド配列
人体内のタンパク質などの重要な物質の合成を導き、人体の正常な生理機能を維持します。
物質レベル: 染色体上のデオキシリボ核酸 (DNA) 配列。
機能レベル: 遺伝情報の伝達者、タンパク質およびリボ核酸 (RNA) の分子機能のコード化、および遺伝子発現の調節。
核酸
分類
DNA (DNA)
核、ミトコンドリア、葉緑体、プラスミド...
遺伝情報の運び手
RNA (RNA)
細胞質、核
分類
リボソームRNA (rRNA)
リボソームの成分
トランスファー RNA (tRNA)
アミノ酸を輸送する
メッセンジャーRNA (mRNA)
DNAから遺伝情報を伝達し、タンパク質合成を誘導する
化学成分
元素組成：C、H、O、N、P
分子組成:
ベース
プリン塩基
ピリミジン塩基
螺旋の内側
ペントース
リボース(U)
デオキシリボース(T)
リン酸
スパイラルチェーンの骨格
基本単位：ヌクレオチド
簡単な歴史
メンデル: エンドウ豆の実験
継承の法則を発見します。同じ因子のペアは分離され、異なる因子のペアは自由に結合されます。
初めて提案された「遺伝的要因」（つまり遺伝子）
モーガン: ショウジョウバエの実験
染色体上の遺伝子
遺伝的連鎖と交換の法則
ワトソン&クリック: DNA二重らせん構造モデル
DNAの右巻き二重らせん構造
DNA複製機構：半保存的複製
遺伝子工学
誕生の基礎
3 つの主要な理論的発見
遺伝情報の担い手はタンパク質ではなくDNA【肺炎球菌形質転換実験】
DNA分子の二重らせん構造モデルと半保存的複製機構
セントラルドグマと演算子理論と遺伝暗号の解読
理論的根拠
すべての生物の DNA の基本構造は同じです。異なる遺伝子も同じ物質基盤を持っているため、遺伝子は組み換えたり交換したりできます。
遺伝子を切断して移すことができるため、機能に影響を与えることなく遺伝子工学を遺伝子操作することができます。
遺伝暗号は普遍的であり、種に関係なく、ポリペプチドと遺伝子の間には対応関係があります。
遺伝子は複製を通じて遺伝情報を次世代に伝えることができます。
テクノロジーの三大発明
DNA分子のin vitro切断・接合技術
遺伝子工学的ベクターの利用
Xu LeiによるDNA分子の分析、寒天ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション技術...
1937: 遺伝子工学の初年度
コンセプト
これは、酵素的方法を使用して異種遺伝子とキャリア DNA を in vitro で組み換えることを指し、得られた組み換え DNA が宿主細胞に導入され、異種遺伝子が宿主細胞内で複製および発現され、それによってレシピエントの形質転換が達成されます。生物学的種や形質、そして人類に必要な生物学的品種や製品を生産する。
分子クローニングまたは組換え DNA 技術としても知られています。
メインコンテンツ
生物体のゲノムから、目的の遺伝子を含む DNA 断片が単離されます。
標的遺伝子を運ぶ外来性 DNA 断片は、選択マークを備えた自己複製ベクター分子に接続されて、組換え DNA 分子を形成します。
組換え DNA 分子は適切な受容細胞 (宿主細胞) に移され、それらとともに増殖します。
多数の細胞増殖集団の中から、組換えDNA分子を取得したレシピエント細胞が選別され、増幅された標的遺伝子が選別されます。
標的遺伝子は発現ベクターにクローニングされ、宿主細胞に導入されることで、新たな遺伝的背景のもとで機能発現を実現し、ヒトに必要な物質を生産します。
基本的なプロセス
切る、つなぐ、移す、追加する、検査するという5つの基本動作単位
目的の遺伝子を含む DNA を分離する
制限酵素がDNA断片を切断（カット）
プラスミドを大腸菌から単離し、消化（消化）します。
リガーゼは酵素消化のために標的遺伝子とプラスミドを接続します（DNA 組換えに接続）
切断とスプライシング: DNA の in vitro 組換え
組換えプラスミドを宿主細胞に導入する（形質転換）
標的遺伝子のクローンを作成し、発現をスクリーニング（増幅と検出）します。
試験：形質転換体のスクリーニングと同定
形質転換と増幅: 組換え DNA 分子の形質転換と増幅
あらゆる生物の遺伝子 → それと関係のない他の受容体細胞
DNAの特定のセグメント → レシピエント細胞内で複製 → 多数の精製DNA断片を調製
4つの要素
ツール酵素
標的遺伝子（準備）
遺伝子ベクター
遺伝子受容体
DNA
分類
染色体DNA
目的の遺伝子を取得する
プラスミドDNA
キャリア
ウイルス、ファージDNA
クローニングベクターの構築、標的遺伝子および遺伝子発現調節因子の単離
ミトコンドリア葉緑体 DNA
目的の遺伝子を取得する
抽出する
生物材料の準備
不純物が少なく、豊富なDNA含有量
プラスミドDNA
菌液培養→対数増殖期後期
植物のDNA
若い部分または苗木、デンプン/糖の蓄積を減らす → DNA 抽出を妨げる
動物のDNA
酵素活性の高い領域を除去する
溶解した細胞
DNA鎖の切断を避けるための適切な溶解
原核生物：リゾチーム、超音波、NaOH、SDS処理または煮沸、凍結処理
真核生物：破砕 → 同上
DNAの分離と精製
溶解後の細胞液→＋タンパク質変性剤[フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール/SDS…]（タンパク質の変性）→遠心分離（タンパク質などの不純物の除去）→有機溶媒[エタノール/イソプロピルアルコール]（タンパク質の凝集・沈殿） DNA) → 溶液を除去 → 粗 DNA → さらなる精製 [フェノール/クロロホルム: 抽出、70% エタノール]
検出：ゲル電気泳動技術
原理
可動性
電界中での電気泳動分子の移動速度
電界強度と自身の正味電荷に比例
誘電体分子の摩擦係数に反比例する
DNA 骨格自体はマイナスに帯電しており、電界中ではプラスの電極に向かって移動します。
DNA の分子量と構成が異なると、電気泳動の移動度が異なり、ゾーンも異なります。
タンパク質または核酸分子の混合物の成分を分離します。
タイプ
寒天ゲル電気泳動
「小さい、広い」: 分離度: 悪い、分離範囲: より良い。
ポリアクリルアミドゲル
ゲル濃度が高いほど細孔が小さくなり、分解能が強くなります。
ツール酵素
制限エンドヌクレアーゼ
コンセプト
基質: 環状または直鎖状二本鎖 DNA
認識: 特殊なヌクレオチド配列
切断: (適切な反応条件) 各鎖の特定のホスホジエステル結合
生成: 3'-OH および 5'-P 遺伝子の DNA 断片
エンドデオキシリボヌクレアーゼ
タイプ
I型酵素
認識部位が遠い、任意の切断、特異性が低い、補因子が必要
II型酵素 ✓
認識部位: 定義された部位内/近くの特定部位、特異的切断、強い特異性、一貫した認識および切断配列、補因子不要または Mg2 のみ
III型酵素
認識部位の外側を切断すると、認識部位は不規則な逆方向反復配列となり、完全に切断された断片が生成されることはほとんどありません。
命名原則
構成: 株番号、株名、単離配列
属名の最初の文字は大文字、種名の最初の 2 文字は小文字、分離順（ローマ字）
機構
認識配列
制限酵素は二本鎖 DNA 上の特殊なヌクレオチド配列を認識できます。
同じ分子は短く、出現確率が高い。
行動様式
酵素切断特性
認識長さ
4～8対の塩基
切断位置
シーケンスの内部または両側を認識します
構造の特定
回文
酵素の種類
レアダイサー
イソシアーゼ
認識順序は同じ
ホモゲナーゼ
認識配列は異なりますが、同じ粘着末端が得られます
切断方法
スティッキーエンド（千鳥カット）
5 フィートのスティッキー エンド (5 フィート短い)
3 フィートのスティッキー エンド (3 フィート短い)
平らな端（面一にカット）
反応系
反応基質（DNA）
エンドヌクレアーゼの投与量（活性によって決定）
反応バッファー (最適 pH 7.5)
適温（37℃程度）
酵素消化識別：ゲル電気泳動技術
DNAリガーゼ
コンセプト
触媒作用: DNA 分子の隣接する 3'-OH 末端と 5'-P 末端の間
形成：ホスホジエステル結合
つまり、二本鎖 DNA 上の隣接するヌクレオチド間の一本鎖ギャップを封鎖します。
大きく分けて2つのタイプがあり、
大腸菌-DNAリガーゼ
粘着末端、補因子が必要: NAD
同じ制限酵素または 2 つの同種の酵素
T4-DNAリガーゼ
粘着性の端、平らな端、補因子が必要: ATP
同じまたは 2 つの制限酵素
非粘着性端と非平坦端による接続
エキソヌクレアーゼ
平らな端
ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ
相補的な粘着端に変更
アルカリホスファターゼ
キャリアの自己環化を防ぐために 5'-P を 5'-OH に変更します
DNAの主な接続方法
相同エンドヌクレアーゼ → 粘着末端
ホモタイラーゼ→スティッキーエンド
さまざまな粘着端
平らに切り、平らに埋める
人工粘着端 - 5 つの突出端
レベルを補う
人工粘着端 - 3 つの突き出た端
人工粘着端 - 平らな端
粘着エンドの交換
その他のツール酵素
DNAポリメラーゼ
PCR増幅
逆転写酵素
cDNAライブラリーの構築
T4ポリヌクレオチドキナーゼ
S1ヌクレアーゼ
標的遺伝子の調製
標的遺伝子
コンセプト
☞単離、形質転換、増幅、発現された、またはこれから単離される特定の遺伝子/DNA 断片は、特定の産物/形質をコードする可能性があります。
別名: 特殊遺伝子または標的遺伝子
ソース
真核生物の染色体ゲノム (ヒトおよび動物)
原核生物の染色体
プラスミド、ウイルス
ミトコンドリア、葉緑体…
方法
直接分解法
原理
染色体DNA → 制限エンドヌクレアーゼ：切断 → すべての断片を連結 → 特定のベクター → 大腸菌に導入 → 増殖 → 適切な方法でスクリーニング → 目的遺伝子を含む組換えコロニー → DNA抽出 → 酵素消化 → 目的遺伝子を取得
物体
原核生物のゲノムは小さく、遺伝子の位置を特定するのが簡単、または既知のヌクレオチド配列を持つ DNA 分子です。
アドバンテージ
素早く簡単に、製品の純度が高くなります。標的遺伝子
遺伝子ライブラリー法
原理
特定の生物のゲノムのすべての遺伝情報 → クローニングベクター → ストレージ: レシピエント細菌のクローン部分集団 (この生物のゲノムライブラリ)。
特定の生物のゲノム内のすべての遺伝子を含む受容細菌のグループは、生物のゲノム ライブラリーと呼ばれます。
化学合成
配列情報が分かれば、目的の遺伝子を入手するのに最も便利な方法です。
PCR増幅法 (ポリメラーゼ連鎖反応)
物質
in vivo DNA複製のin vitroシミュレーション
原理
サイクル
性転換者
94℃
加熱・アルカリ、DNA二本鎖→水素結合切断→一本鎖
アニーリング
55℃
テンプレートとプライマーの再生
伸ばす
72℃
特定の DNS シーケンス: 幾何級数的な指数関数的な増加
PCR反応工程・反応ステップ
鋳型DNAの変性
鋳型DNAを94～95℃で一定時間加熱すると、鋳型DNAの二本鎖DNAまたはPCR増幅により形成された二本鎖DNAが解離して一本鎖になり、DNAと結合できるようになります。プライマーを塗布し、次の反応ラウンドの準備をします。
鋳型DNAとプライマーのアニーリング（再生）
鋳型 DNA が加熱されて一本鎖に変性した後、温度は約 55℃まで下がり、プライマーは鋳型 DNA 一本鎖の相補配列と対形成します。
プライマーエクステンション
Taq DNA ポリメラーゼの作用下で、DNA テンプレートとプライマーの複合体は、塩基対形成と半保存的複製の原理に従って、反応原料として dNTP を使用し、新しい半保存的複製相補鎖を形成します。テンプレートDNA鎖が合成されます。
PCR反応装置
反応バッファー
基質：dNTP（4種類のデオキシヌクレオチド：dATP、dGTP、dTT、dCTP）
プライマー×2
テンプレート: DNA 分子
Taq酵素（DNAポリメラーゼ）
Mg2 (酵素補因子)
PCRの特徴
高感度
強い特異性
シンプル、高速、再現可能
サンプル純度に対する低い要件
キャリア
遺伝子キャリアの概念
外来 DNA または標的遺伝子を適切な宿主細胞に導入するツールまたはキャリア
運送業者は条件を満たしている必要があります
相対分子量は小さく、標的遺伝子を受け取るのに適しています。
宿主細胞内で独立して安定した自己複製を行うことができ、外来DNAが挿入されても安定した複製と遺伝的特性を維持することができます。
宿主細胞 (受容体) の選択可能なマーカーを提供し、スクリーニングを容易にするための識別可能な表現型の特徴を備えています。
その DNA 配列には、適切な単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位があり、この部位は DNA 複製に必須ではない領域に位置しており、特定の制限エンドヌクレアーゼによって切断された後、プラスミド DNA は閉じたり開いたりすることができます。自分自身の断片を失うことなく、DNA 断片をソースします。
プラスミド
コンセプト
二重らせん閉環 DNA 分子
複製と継承は染色体から独立しており、複製と転写は宿主にコードされた酵素とタンパク質に依存します。
対染色体
すべては生物学的遺伝学に関連する
化学的に異なる
染色体: タンパク質と DNA
プラスミド: DNA
タイプ
タイトタイプ
コピーは 1 つだけ、または多くても数個しかありません。
リラックスした
一般的に使用されるプラスミドベクター
大腸菌プラスミドベクター
2 つの抗生物質耐性遺伝子
乳糖オペロン：lacZ遺伝子→β-ガラクトシダーゼ→加水分解X-gal（lacZ青白斑点スクリーニング）
プラスミドDNAの抽出
選択的抽出
穏やかな条件下では、リゾチームを使用して細菌が溶解され、染色体 DNA とプラスミド DNA の相対分子量の違いにより、得られた細胞断片が高速遠心分離によって分離されます。上清には比較的分子量の小さいプラスミドDNAが残存し、これをエタノールで沈殿させて粗プラスミドDNAを得る。
アルカリSDS法
pH 12.0 ～ 12.5 の範囲内で染色体内の二重らせん開鎖 DNA を選択的に変性しますが、閉ループ二本鎖 DNA は変化しません。酢酸ナトリウムで中和した後、SDS によりタンパク質-SDS 複合体と相対分子量の高い DNA が沈殿し、プラスミド DNA が上清に残され、高速遠心分離によって分離されます。
プラスミドDNAの精製
アルカリショ糖密度勾配遠心分離
染色体二重らせんの開鎖DNAは変性しやすいのに対し、閉環二本鎖プラスミドDNAは変性しにくいため、ショ糖濃度勾配中ではプラスミドDNAが変性DNAよりも早く沈降し、分離・精製されます。
塩化セシウム-臭化エチジウム(Et-Br)密度勾配遠心法
染色体の二重らせんの開鎖DNAは色素Et-Brと結合しやすく、密度が低くなり、プラスミドDNAは密度が高く分離されます。遠心分離による。
ニトロセルロース膜吸着法
ニトロセルロース膜は一本鎖DNAを吸着し、染色体DNAは容易に変性して一本鎖DNAとなり、プラスミドDNAから分離されます。
変形して構築する
不要な領域を削除する
新しい遺伝マーカー遺伝子を追加する
複数の制限酵素認識および切断部位、つまり複数のクローニング部位を備えた DNA 配列を導入します。
ラムダファージ
ファージ
宿主細胞から独立して複製することはできず、生細胞内でのみ増殖でき、厳密に宿主細胞に特異的です。
主な種類
ベクトルを挿入
置換ベクトル
その他の通信事業者
遺伝子組換え
コンセプト
標的遺伝子とベクター: in vitro 組み合わせ → 組換え。
再編手法
主に粘着端
ダイレクトボンディング
シンプルかつ効率的
テールボンディングを追加
ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して DNA 末端に粘着末端を作成する
主要ツール酵素: T4-DNA リガーゼ (5'-P および 3'-OH)
DNA組換え
① 同じエンドヌクレアーゼによって生成される粘着末端のライゲーション
② ホモ酵素により生成される粘着末端のライゲーション
③異なる粘着端の接続
④人工粘着端の接続（5’突出端、3’突出端、平坦端）
⑤ 粘着エンドの交換
組換え率 = 外来 DNA を含む組換え成分の指数 / ベクター分子数、日常的な実験条件: 25 ～ 75%
遺伝子変換と発現
標的遺伝子がレシピエント細胞に導入される
宿主細胞（受容体細胞）
コンセプト
形質転換、形質導入、ハイブリダイゼーション中に外来遺伝子 DNA を受け取る細胞
組換え増幅部位です
タイプ
原核細胞
大腸菌、枯草菌
真核細胞
酵母（主に）
特徴
単細胞
非病原性、安全
能力
能力
宿主細胞は外因性 DNA 分子を吸収し、特定の生理学的状態において形質転換受容体として効果的に作用します。
に応じて
受容体細胞自体の生理的状態
組換えDNA分子の構造とサイズ
対数増殖期の一般宿主細胞：形質転換能力Max
コンピテントセル
外部の DNA 分子を吸収できる生理学的状態にある細胞。
変換する
無傷の細菌細胞の Ca2 誘導形質転換
エレクトロポレーション変換
変換速度
コンセプト
影響を与える要因
増幅スクリーニング
増幅する
スクリーニング方法
ベクター抗生物質耐性遺伝子と対応する選択された薬剤に基づくスクリーニング
二重の抗生物質耐性マーカーを有するプラスミドベクターで大腸菌を形質転換するためのスクリーニング方法
キャリア: Amp (アンピシリン耐性)、Tet (テトラサイクリン耐性)
外来遺伝子が抗生物質耐性遺伝子の 1 つに挿入され、その不活化が引き起こされる
組換え体をスクリーニングするための 2 枚の抗生物質プレート
ステップ
①ポジティブセレクション
非挿入不活化耐性遺伝子に対応する抗生物質を含有
形質転換体√
目的遺伝子を含むプラスミドを含む形質転換体 √
組換え標的遺伝子を含む形質転換体 √
非形質転換×
②ネガティブセレクション
挿入により不活化された耐性遺伝子を含む抗生物質
目的遺伝子を含まない非組換え形質転換体√
目的遺伝子の組換え体を含む形質転換体 ×
2つの培地の比較 → 選択：目的遺伝子の組換え体を含む形質転換体
乳糖オペロン（青白スポット）のlacZ遺伝子を用いたスクリーニング
完全な乳糖オペロンを持つ細菌は、β-ガラクトシダーゼをコードする LacZ 遺伝子を翻訳できる → X-gal を加水分解 → 青色
外来遺伝子挿入→LacZ遺伝子発現不能→白色
必須：不活化抗生物質耐性遺伝子挿入なし → アンピシリン培地
目的遺伝子を含むプラスミドを含む形質転換体：ブルー株
組換え目的遺伝子を含む形質転換体：ホワイト株
組換え体を識別するための DNA チップの応用
多くの特定の DNA オリゴヌクレオチド/DNA フラグメント (プローブ) → 固定: チップのプリセット位置
検査サンプル：ラベル → チップとハイブリダイズ（相補的塩基対形成の原理） → ハイブリダイゼーションシグナル検出＆コンピューター解析
標的遺伝子翻訳産物（タンパク質、酵素、ポリペプチド）に基づくスクリーニング 【マーカー遺伝子がない、またはプローブが合成できない】
プロテインゲル電気泳動
ページ
免疫測定法
エリサ
ウェスタンブロッティング
免疫沈降
固相ラジオイムノアッセイ
標的遺伝子の発現
食品業界での応用: 遺伝子組み換え食品
遺伝子組み換え微生物食品
意味
バクテリアを工学的に操作する
特徴
応用
(1) 食品の品質向上
(2) 生産工程の簡素化と生産サイクルの短縮
(3)食品の抗菌・防腐保存
(4) 食品用酵素生産菌の改良
(5) 健康食品用機能性素材の製造
(6) 食品微生物の迅速な検出
遺伝子組み換え動物性食品
関与するタイプ
メインアプリケーション
家畜の産卵率を変更する。
特に乳児や幼児向けの乳製品の栄養成分を改善する
バイオリアクターによるヒト血清タンパク質等の製造。
遺伝子組み換え植物性食品
意味
タイプ
応用
食材の品質向上
食品生産プロセスの改善
食品添加物・機能性食品の製造