二本鎖 DNA 分子の 4 ～ 8 塩基対の特定の配列を認識します

ほとんどの酵素の切断部位は、認識配列内またはその両側にあります。

切断シーケンスを古典的な回転対称回文構造として特定する

DNA を切断して 5' リン酸基と 3' ヒドロキシル基を含む末端を生成します

オフセットカットでは粘着性のある端が生成され、対称軸に沿ったカットでは平坦な端が生成されます。

ほとんどの II 型酵素は同様の反応条件を必要とします

複数の酵素を組み合わせた酵素加水分解

不純物：タンパク質、フェノール、クロロホルム、エタノール、EDTA、SDS、NaCなど

アプローチ

特定の制限エンドヌクレアーゼは、スーパーコイル状のプラスミド DNA またはウイルス DNA を切断するのに、直鎖状 DNA を消化するよりも何倍も多くの酵素を必要とします。

一部の核酸制限エンドヌクレアーゼは異なる位置で制限酵素部位を切断し、それらの効率も大きく異なります。

5'->3' DNA ポリメラーゼ活性

5'->3' エキソヌクレアーゼ活性

3'->5' エキソヌクレアーゼ活性

ニックトランスレーション: 5'->3' エキソヌクレアーゼとポリメラーゼの活性が連携してニックを進めます。

32P 標識 DNA プローブの調製

出典: 大腸菌 DNA ポリメラーゼ I をサブチリシンで処理して、大きなペプチド セグメントの N 末端 3 分の 1 を取得します。これがクレノウ酵素です。

5'->3' DNA ポリメラーゼ活性を有する 3'->5' エキソヌクレアーゼ活性を有する 5'->3' エキソヌクレアーゼ活性の喪失

1||| エンドヌクレアーゼによって生成された 5' 粘着末端を埋める

2||| DNA断片の同位体末端標識

3||| cDNA第二鎖合成

4||| ジデオキシ鎖末端停止法によるDNA配列の決定

① 5'→3' DNA ポリメラーゼ活性 ② 3'->5' エキソヌクレオチド分解ポリメラーゼ活性 ③ 5'->3' エキソヌクレアーゼ活性の欠如 ④ dNTP が存在しない場合、任意の 3'-OH 末端からエキソ切断が可能 ⑤ dNTP が 1 種類のみの場合、相補的ヌクレオチドが露出するとエキソリシスは停止します。 ⑥ 4 つの dNTP がすべて存在する場合、重合活性が支配的になる

①エンドヌクレアーゼにより生成される3'粘着末端を切断します。

② DNA断片の同位体末端標識

① 5'→3' DNA ポリメラーゼ活性 ② 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性 ③既知のDNAポリメラーゼの中で最も強い処理能力を有する ④修飾後は、ジデオキシチェーンターミネーション法を用いた長い断片DNAの配列決定酵素となります。

より長い DNA フラグメントのプライマー伸長反応

フィルインまたは交換（置換）反応による迅速な末端標識

出典: 子牛の胸腺

テンプレートフリー DNA ポリメラーゼは 3'-OH 末端に dTNP をランダムに組み込む

ベクターまたはターゲット DNA に相補的なホモポリマー テールを追加します

DNA 断片の 3' 末端の同位体標識

(1) RNAによるcDNA合成

(2) DNA-RNAハイブリッド鎖におけるRNA鎖の双方向切除（RNase H活性）

(3) DNA 誘導性 DNA 重合活性

AMV：精製鳥骨髄芽腫ウイルス由来の逆転写酵素（42℃で機能）

MMLV：大腸菌におけるモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素遺伝子の発現産物（37℃で機能）

真核生物の遺伝子のRNAをDNAに転写し、cDNAライブラリを構築する

5' オーバーハングを持つ DNA 断片の 3' 末端を評価してラベルし、プローブを準備します

DNA配列決定用のKlenowフラグメントを置き換えます

ベクター DNA の 5' 末端リン酸基を除去して、ベクター自体の環化を防ぎ、組換え率を向上させます。

DNA および RNA から 5' リン酸基を除去し、T4 ポリヌクレオチド キナーゼで末端標識します。

① 一本鎖 DNA または RNA のエンドキューション

② 内部に切れ目や亀裂のある二本鎖 DNA または RNA

① DNA断片の一本鎖オーバーハングを除去し、平滑末端化します。 ② cDNA合成時に形成されるヘアピン構造を除去する ③ S1ヌクレアーゼ防御実験によるmRNA量の解析 ④ 成熟mRNAとゲノムDNAのハイブリダイゼーションと、この酵素による加水分解を組み合わせることで、イントロンの位置を特定することができます。 ⑤ 進行性欠失変異の末端をトリミングする