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Tossicologia 4 Nozioni di base sugli esperimenti di tossicologia
Questo quadro introduce i principi e i limiti degli esperimenti tossicologici, lo scopo fondamentale degli esperimenti tossicologici, la selezione e la gestione degli animali da esperimento, i metodi sperimentali sugli animali, l'analisi statistica dei risultati sperimentali tossicologici e, spero, il controllo di qualità degli esperimenti tossicologici utile a tutti aiuto!
Modifié à 2024-02-18 11:49:24
Tossicologia 4 Nozioni di base sugli esperimenti di tossicologia
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Tossicologia 4 Nozioni di base sugli esperimenti di tossicologia
Domande di ripasso dopo la lezione
1. Quali sono le ragioni dell'incertezza nell'estrapolazione dei risultati sperimentali sugli animali per l'uomo?
2. Quali principi di base dovrebbero essere seguiti nella progettazione degli esperimenti tossicologici?
3. Quali questioni dovrebbero essere considerate per determinare se i risultati sperimentali hanno un significato biologico?
Quali sono i tipi e gli scopi degli esperimenti tossicologici?
Esperimenti in vitro
Esaminare, prevedere la tossicità, esplorare i meccanismi
Esperimenti in vivo
Valutazione della tossicità: animali → esseri umani
ricerca sulla popolazione
Verifica dei risultati degli esperimenti sugli animali
1. Principi e limiti degli esperimenti tossicologici
1. Principi base degli esperimenti tossicologici
1. Gli effetti sugli animali da esperimento possono essere estrapolati all'uomo
①La specie animale più sensibile è l'uomo.
②I processi biologici e il metabolismo chimico dell'uomo e degli animali da esperimento sono correlati al peso corporeo o alla superficie corporea.
I due presupposti precedenti sono la premessa di tutta la biologia e medicina sperimentale.
2. Gli animali da esperimento devono essere esposti a dosi elevate
Secondo la definizione di risposta qualitativa, l’incidenza degli effetti di gruppo aumenta all’aumentare dei livelli di esposizione.
Impostare 3 o più gruppi di dose e osservare la relazione dose-risposta.
Maggiore è la distanza tra il LOAEL e la dose di esposizione umana, più è sicuro.
3. I soggetti sperimentali sono animali adulti sani.
Gli animali adulti sani fungono da modelli sperimentali rappresentativi per la popolazione generale, rendendo i risultati sperimentali rappresentativi e riproducibili.
4. La via di avvelenamento è la possibile via di esposizione per l'uomo.
2. Limitazioni degli esperimenti tossicologici
L’estrapolazione dagli esperimenti sugli animali all’uomo è incerta
Vi è incertezza nell’estrapolare dosi elevate a dosi basse
L’estrapolazione da un piccolo numero di animali a un gran numero di persone è incerta
Di solito vengono utilizzati animali adulti sani e la reazione è relativamente semplice.
3. Principi delle “3R” ed etica della sperimentazione animale
Principio delle "3R".
sostituzione
Un metodo scientifico che utilizza esperimenti o altre ricerche condotte con metodi diversi dagli animali per raggiungere uno scopo sperimentale o che utilizza materiali sperimentali non senzienti invece di animali vertebrati coscienti per gli esperimenti.
riduzione
Un metodo per ottenere la stessa quantità di dati sperimentali con meno animali o per ottenere più dati sperimentali con un certo numero di animali.
Raffinatezza
Metodi che migliorano e perfezionano le procedure sperimentali per alleviare o ridurre il dolore e il disagio degli animali e garantire il benessere degli animali.
Problemi etici nella sperimentazione animale
legge
"Legge Martin", "Regolamento sulla somministrazione di animali da laboratorio"
rispettare i principi
Fornire una gestione e un trattamento umani degli animali da esperimento; ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali da esperimento; evitare l'uso non necessario degli animali da esperimento.
Principi etici della sperimentazione umana
principio del consenso informato
Principio del beneficio senza danno
principio dello scopo medico
principio scientifico
principio di controllo sperimentale
2. Scopi fondamentali degli esperimenti tossicologici
Lo scopo fondamentale della valutazione della sicurezza
Osservare gli effetti tossici e le proprietà della sostanza in esame
Studi sulla relazione dose-risposta (effetto).
Determinare gli organi bersaglio della tossicità
Determinare la reversibilità del danno
Altri scopi degli esperimenti tossicologici
Indicatori sensibili di rilevamento degli effetti tossici
marcatori biologici
meccanismo di avvelenamento
Tossicocinetica delle sostanze in esame
Metabolismo della sostanza in esame e misure di salvataggio in caso di avvelenamento
3. Selezione e gestione degli animali da esperimento
animale da laboratorio
Gli animali allevati artificialmente e i microrganismi che trasportano sono controllati, con un chiaro background genetico e una chiara origine. Viene utilizzato principalmente per la ricerca scientifica, la valutazione dell'efficacia e della sicurezza di farmaci e prodotti biologici e l'insegnamento.
Selezione delle specie animali da esperimento
Scegli generalmente due specie: roditori e non roditori
Il principio fondamentale
① Le caratteristiche metaboliche, biochimiche e tossicologiche sono simili a quelle umane
②Durata della vita naturale più breve
③Facile da gestire e utilizzare
④Economico e facile da ottenere
Selezione di ceppi animali da esperimento
Ceppo: termine proprio della zoologia sperimentale, che si riferisce a un gruppo di animali derivati dallo stesso antenato attraverso metodi di accoppiamento pianificato, oppure ad animali, piante o microrganismi derivati dallo stesso antenato e aventi un genotipo specifico.
Animali sperimentali classificati mediante controllo genetico
consanguineo
Un ceppo puro di animale allevato da continui accoppiamenti tra fratelli o genitori e figli da più di venti generazioni. Ad esempio, i topi hanno BALB/C, Jinbai I, Jinbai II, ecc.
Animali del gruppo ibrido (incrocio 1 generazione, F1)
La prima generazione di animali risultante dall'accoppiamento mirato di due diversi ceppi consanguinei. C'è chiara ereditarietà e vigore ibrido.
gruppo chiuso
Una popolazione è un gruppo di animali che non introduce nuovo sangue dall'esterno per più di 5 anni, ed è solo un gruppo di animali dello stesso ceppo che vengono accoppiati casualmente e riprodotti in un luogo fisso. Come topi Kunming, topi NIH, ratti Wistar, ecc. Più utilizzato nella ricerca tossicologica.
Parametri di controllo microbiologico per animali da esperimento
Animale convenzionale (CVA)
Animale Pulito (CLA)
Nei test di tossicità e negli studi tossicologici, dovrebbero essere utilizzati animali CLA o superiori per garantire l'affidabilità dei risultati sperimentali.
Animale esente da agenti patogeni specifici (SPF)
Animale esente da germi (GFA)
Standard di grado microbico per animali da laboratorio
Livello I: CVA, sistema aperto, nessuna malattia trasmissibile che può essere trasmessa all'uomo.
Livello II: CLA, sistema barriera, oltre agli standard di Livello I, la linea di specie è chiara e non esistono malattie infettive specifiche per l'animale.
Livello III: SPF, barriera o sistema di isolamento, in aggiunta agli standard di Livello II, allevati secondo i requisiti della linea pura, allevati in un isolatore o in una sala a flusso laminare, possono avere colonie batteriche non patogene e nessun agente patogeno patogeno.
Livello IV: GFA, sistema di isolamento, animali puri allevati in condizioni sterili completamente chiuse, senza microrganismi e parassiti (inclusa la maggior parte dei virus) esterni agli animali.
Selezione individuale di animali da esperimento
genere
età e peso
Stato fisiologico
Stato di salute
Struttura della struttura per animali da laboratorio
Area accoglienza e quarantena animali
Area sperimentale e alimentazione animali
Area di stoccaggio di mangime, biancheria da letto e forniture
Zona lavaggio e disinfezione
Area di stoccaggio e lavorazione dei rifiuti
zona gestionale
Tipi di strutture per animali da sperimentazione
sistema aperto: ambiente ordinario
Sistema di barriera: pulizia classe 10.000
Sistema di isolamento: livello di pulizia 100
4. Metodi di sperimentazione sugli animali
Principi di progettazione degli esperimenti sugli animali
principio di randomizzazione
Completamente randomizzato (disegno a fattore singolo)
Randomizzazione stratificata (disegno corrispondente)
Principio di contrasto
Controlli comuni per i test tossicologici
Controllo non trattato (controllo in bianco)
Nessun fattore di lavorazione, nessuna sostanza di prova, nessuna operazione
Determinare il valore di fondo delle caratteristiche biologiche, controllo di qualità
Controllo negativo (controllo solvente)
Non ci sono fattori di lavorazione, vengono forniti i fattori sperimentali necessari (solventi) e l'influenza dei fattori sperimentali (solventi) viene eliminata.
controllo positivo
Utilizzare i positivi noti per testare l'efficacia del sistema sperimentale.
I test di tossicologia genetica, i test di teratogenicità e i test di cancerogenicità hanno tutti gruppi di controllo positivi.
autocontrollo
Gli stessi soggetti di ricerca sono stati confrontati prima e dopo il trattamento. Ad esempio, osserva i cambiamenti della pressione sanguigna prima e dopo l'assunzione del medicinale.
È necessario che le condizioni sperimentali prima e dopo il trattamento del fattore di ricerca siano coerenti e che i parametri osservati siano stabili.
Confronto storico
Consiste nei dati del gruppo di controllo provenienti da più esperimenti passati nello stesso laboratorio.
Controllare la stabilità del sistema sperimentale attraverso test di omogeneità per controllare e garantire la qualità del laboratorio.
Principio di ripetizione
Ripetizione dell'intero esperimento
Garantire la riproducibilità dei risultati sperimentali.
Osservazioni ripetute di più soggetti
Ci deve essere una dimensione del campione sufficiente per ciascun gruppo.
Punti chiave della progettazione di esperimenti sugli animali
Raggruppamento della dose per test tossicologici in vivo
Numero di animali in ciascun gruppo
Periodo di prova
Preparazione prima degli esperimenti sugli animali
Dopo l'acquisto degli animali da esperimento, i maschi e le femmine dovrebbero essere tenuti separati.
Generalmente, la quarantena viene condotta per 5-7 giorni.
Identificazione del genere degli animali da esperimento comunemente utilizzati
Preparazione prima dell'esposizione al veleno
Raggruppamento di animali
Pesatura, numerazione, raggruppamento casuale
Preparazione della sostanza di prova
Raggruppamento della dose, volume di esposizione, diluizione
Scelta della via di esposizione
Tratto gastrointestinale, tratto respiratorio, pelle, sottocutaneo, intradermico, muscolare, cavità addominale, vena
Preparazione della sostanza di prova
Preparati di veleno
Forme di dosaggio comuni: soluzione acquosa, sospensione, soluzione oleosa
Le sostanze di prova idrosolubili rimangono coerenti con la pressione osmotica nel corpo
Sostanza di prova insolubile in acqua, disciolta o sospesa in un solvente organico appropriato
La sostanza in esame dovrebbe generalmente essere preparata fresca prima dell'uso.
Punti chiave nella preparazione dei preparati veleni
Durante la preparazione, non riscaldare l'oggetto da testare a una temperatura che ne modificherebbe le proprietà fisiche e chimiche.
Per valutare la tossicità cutanea delle sostanze solide in esame è necessario mantenerne la forma e la dimensione delle particelle
Preparare la sostanza di prova multicomponente secondo la formula in modo che la preparazione rifletta accuratamente la miscela originale
I preparati dovrebbero mantenere la stabilità chimica e la coerenza con la sostanza in esame
La preparazione deve ridurre il volume totale del test e non utilizzare una quantità eccessiva di solvente o eccipiente.
I preparativi dovrebbero essere facili da preparare per l'esposizione
Il pH del preparato è ottimale tra 5 e 9
Non utilizzare acidi o basi per dissociare la sostanza in esame
Per l'avvelenamento parenterale, la soluzione finale dovrebbe essere quanto più isotonica possibile
Vie di esposizione degli animali da esperimento
Esposizione orale (gastrointestinale).
Ingoiare le capsule
alimentazione
Somministrazione orale
Infezione attraverso le vie respiratorie
Ricerca sui veleni chimici esistenti sotto forma di gas, vapore, polvere, fumo, nebbia, ecc. in condizioni di produzione e valutazione degli inquinanti atmosferici ambientali
Esposizione inalatoria: statica e dinamica
Iniezione intratracheale: eseguita dopo l'anestesia
esposizione della pelle
Veleni chimici allo stato liquido, gassoso o anche polveroso
La maggior parte di loro sceglie conigli e porcellini d'India. La pelle su entrambi i lati della colonna vertebrale dell'animale viene depilata, il veleno chimico viene applicato localmente e viene coperto e fissato con una campana di vetro, carta oleata o pellicola di plastica per un certo periodo di tempo. tempo.
Pesticidi, cosmetici, inquinanti ambientali, farmaci topici
Ratti comunemente usati
Modi di esposizione
Depilazione: depilazione chimica o meccanica
Esposizione al veleno: applicazione locale o metodo dell'immersione della coda
Esposizione tramite iniezione
iniezione intraperitoneale
iniezione intravenosa
iniezione intramuscolare
iniezione sottocutanea
Raccolta di campioni biologici
Raccolta urine e feci
Raccolta di campioni di organi
Raccolta della bile
raccolta del sangue
FINE
Prelievo di sangue non terminale
Il volume del singolo prelievo di sangue è inferiore al 15% del volume di sangue totale dell'animale e non avrà alcun effetto sull'animale.
Se il volume del sangue è compreso tra il 15% e il 20% del volume totale del sangue, si verificheranno effetti collaterali.
Prelievi multipli di sangue ogni 24 ore non devono superare l'1% del volume totale del sangue
anestesia
Anestesia generale (sodio pentobarbital) e locale (procaina, ecc.)
eutanasia
Il processo di uccisione degli animali utilizzando metodi umani e riconosciuti pubblicamente in modo che muoiano in silenzio e senza dolore, senza paura o ansia.
Anatomia patologica e raccolta di campioni
L'esame patologico è una parte importante dei test tossicologici e gli studi patologici possono aiutare a determinare gli effetti dannosi e gli organi bersaglio. L'esame patologico comprende l'anatomia macroscopica e l'esame istopatologico.
anatomia
Entro mezz'ora dal sacrificio degli animali da esperimento, questi sono stati sezionati utilizzando il metodo di estrazione combinata degli organi toracici e addominali.
Osservare la forma, le condizioni della superficie, il colore, il bordo, la dimensione, la struttura e la sezione degli organi interessati.
Pesare gli organi designati e calcolare i coefficienti degli organi.
Procedure operative standard per l'anatomia patologica degli animali da laboratorio
1. Fissare l'animale sulla tavola da dissezione e sezionare il collo (ghiandola parotide, linfonodi, ecc.)
2. Prendi un lato della pelle del seno e della vita, apri l'addome ed espandi l'incisione (organi addominali interni)
3. Apertura del torace (organi interni del torace, lingua e gola, trachea, tiroide, ecc.)
4. Staccare l'arto posteriore sinistro (muscoli, ecc.), il cuoio capelluto e le orecchie, aprire il cranio ed esporre il midollo spinale.
Esame istopatologico
Utilizzare un coltello affilato per tagliare l'organo o il tessuto designato e unire le parti.
I blocchi di tessuto vengono solitamente fissati in un volume 10 volte maggiore di una soluzione di formaldeide al 10% e quindi preparati di routine (inclusione in paraffina del tessuto, sezionamento e colorazione con HE).
Osservare e registrare al microscopio per effettuare la diagnosi patologica.
5. Analisi statistica dei risultati degli esperimenti tossicologici
Analisi statistica dei risultati
Confronto a coppie tra ciascun gruppo di trattamento e il gruppo di controllo negativo e confronto tra più gruppi di trattamento e il gruppo di controllo negativo
relazione dose-risposta e relazione dose-risposta
tabella di controllo qualità
Domande a cui è necessario rispondere quando si valutano i risultati dei test tossicologici
È statisticamente significativo?
È biologicamente significativo?
Se ha un significato tossicologico, cioè se ha effetti dannosi
Problemi da considerare nel determinare il significato biologico
Confronto longitudinale: se esiste una relazione dose-risposta per le variazioni di questo parametro.
Confronto orizzontale: se i cambiamenti in questo parametro sono accompagnati da cambiamenti in altri indicatori correlati.
La differenza tra le medie del gruppo di trattamento e del gruppo di controllo è più del doppio dell'errore di rilevamento.
Problemi da considerare nel determinare il significato biologico
Confronto con controlli storici: il valore normale di riferimento dell'animale da esperimento è composto dai risultati del controllo negativo di almeno 10 esperimenti indipendenti recentemente condotti in questo laboratorio utilizzando lo stesso ceppo di animali da esperimento e lo stesso solvente, e la sua media ±1,96 × standard l'errore viene utilizzato come intervallo di valori di riferimento. I controlli negativi devono rientrare entro ±3 volte l'errore standard della media dei controlli storici.
Se un determinato valore osservato nel gruppo di trattamento viene confrontato con il gruppo di controllo, la differenza è statisticamente significativa e, se soddisfa una delle seguenti condizioni, si può considerare che abbia superato il normale intervallo dei valori di riferimento e costituisca un effetto dannoso.
①Il valore supera il normale intervallo di valori di riferimento
②Il valore rientra nell'intervallo di valori di riferimento normale, ma la differenza continua per un periodo di tempo dopo l'interruzione del contatto.
③Il valore rientra nell'intervallo di valori di riferimento normale, ma se il corpo è in uno stato di stress funzionale o biochimico, la differenza sarà più evidente.
Significato statistico e significato biologico dei risultati dei test tossicologici
6. Controllo di qualità degli esperimenti tossicologici
Buona pratica di laboratorio (GLP)
Si tratta di un regolamento di gestione formulato per la valutazione della tossicità di farmaci, additivi alimentari, pesticidi, cosmetici e altri articoli medici.
Si tratta di un documento normativo che regola un sistema di gestione organizzativa completo per la ricerca sulla sicurezza non clinica relativa alla salute umana e all'ambiente, compresa la pianificazione sperimentale, l'implementazione, la supervisione, le registrazioni e la gestione dei file.
La storia dello sviluppo della GLP in patria e all'estero
I paesi sviluppati hanno iniziato a sviluppare e implementare formalmente la GLP negli anni ’60 e ’70.
I paesi che hanno implementato i sistemi GLP includono Stati Uniti, Giappone, Regno Unito, Germania, Paesi Bassi, Svezia e Svizzera.
Alla fine degli anni '80, il mio paese ha successivamente condotto attività di ricerca e implementazione della GLP su farmaci e altri prodotti e veleni correlati.
Scopo e significato
Finalizzato all'organizzazione e alla gestione delle attività di ricerca del personale scientifico e tecnologico
Promuovere i ricercatori per migliorare la qualità e la validità dei dati sperimentali
Promuovere il riconoscimento reciproco dei dati sperimentali a livello internazionale
Evita inutili duplicazioni di esperimenti e riduci lo spreco di risorse
Garantire l'affidabilità, l'integrità e la ripetibilità dei risultati sperimentali
Contenuti fondamentali
Requisiti per le organizzazioni e il personale
Requisiti per strutture sperimentali, strumenti, attrezzature e materiali sperimentali
Procedure operative standard (SOP)
Requisiti per il processo di attuazione del lavoro di ricerca
Requisiti per gli archivi e la loro gestione
Certificazione di qualificazione del laboratorio, supervisione e ispezione
SOP-Procedure operative standard
Lo scopo è garantire la riproducibilità operativa e la credibilità dei risultati
Quando il personale che ha ricevuto istruzione e formazione esegue i test secondo la SOP, la riproducibilità delle operazioni di test e dei risultati operativi è migliore.
Nello stesso istituto di ricerca o laboratorio, se persone diverse eseguono operazioni e test secondo la SOP, si possono garantire risultati più coerenti.
sistema organizzativo
Unità di garanzia della qualità (QAU—Unità di garanzia della qualità)
QAU si riferisce al dipartimento o all'organizzazione all'interno dell'agenzia di ispezione responsabile di garantire che il proprio lavoro sia conforme alle specifiche GLP.
QAU è la chiave per la costruzione GLP. Avere un buon piano sperimentale e procedure operative standard per varie operazioni specifiche non garantisce necessariamente risultati dei test di alta qualità.
Leader del progetto (Direttore dello studio SD)
Si riferisce alla persona responsabile dell'organizzazione e dell'attuazione di un determinato lavoro di ricerca o ispezione. SD è la figura centrale della gestione organizzativa specifica dell'organismo di ispezione. Possedere un'ampia struttura di conoscenze e una ricca esperienza lavorativa. La coltivazione e la qualità della SD sono cruciali per i laboratori GLP.
Controllo di qualità del disegno sperimentale tossicologico
Punti chiave nella progettazione di esperimenti di tossicologia in vivo
Raggruppamento della dose per test tossicologici in vivo
Numero di animali in ciascun gruppo
Periodo di prova
Progettazione di test tossicologici in vitro
Testare la solubilità della sostanza in esame
Raccomandazione della dose più alta da testare (10mmol/L o 5mg/ml)
Attivazione metabolica (omogenato di fegato di ratto maschio adulto pretrattato PCB 1254, 90.000 g di surnatante centrifugo (S9) e sistema di rigenerazione NADPH)
Controllo di qualità durante l'esecuzione di esperimenti tossicologici
Procedure operative e di gestione del laboratorio
Gestione dei reagenti
Gestione dello strumento
gestione ambientale
Gestione degli animali da laboratorio
Gestione cieca
tabella di controllo qualità
Controllo di qualità dell'analisi dei risultati degli esperimenti tossicologici
Analisi statistica dei dati sperimentali
Valutazione dei risultati sperimentali
Domande di pensiero
Poiché i test sulla tossicità cronica hanno un ciclo lungo, consumano molti animali e richiedono molta manodopera e risorse materiali, come garantire l’affidabilità dei test cronici sugli animali?
Il controllo di qualità del laboratorio è un prerequisito per garantire il successo del test e la scientificità e accuratezza dei dati sperimentali.
I test di tossicità cronica devono essere gestiti secondo la Buona Pratica di Laboratorio (GLP).
Comprende una progettazione sperimentale ragionevole, la selezione e la gestione degli animali, la preparazione e la gestione delle sostanze di prova, l'operazione sperimentale e il controllo delle condizioni di prova.