Wondershare EdrawMind
Галерея диаграмм связей Генная инженерия
- 3
Генная инженерия
Это интеллектуальная карта генной инженерии с подробным введением и исчерпывающим описанием. Я надеюсь, что она будет полезна заинтересованным друзьям.
Отредактировано в 2023-11-24 01:34:49
- Рекомендовано вам
- Структура
Генная инженерия
Ген
концепция
Определенная последовательность нуклеотидов, оказывающая генетическое влияние на молекулу ДНК.
Направляйте синтез важных веществ, таких как белки, в организме человека и поддерживайте нормальные физиологические функции человеческого организма.
Материальный уровень: последовательность дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) на хромосоме.
Функциональный уровень: носитель генетической информации, кодирующий молекулярные функции белка и рибонуклеиновой кислоты (РНК) и регулирующий экспрессию генов.
нуклеиновая кислота
Классификация
ДНК (ДНК)
Ядро, митохондрии, хлоропласты, плазмиды...
носитель генетической информации
РНК (РНК)
Цитоплазма, ядро
Классификация
Рибосомальная РНК (рРНК)
компоненты рибосом
Транспортная РНК (тРНК)
транспорт аминокислот
Информационная РНК (мРНК)
Передаёт генетическую информацию из ДНК и управляет синтезом белка.
химические компоненты
Элементный состав: C, H, O, N, P
Молекулярный состав:
база
пуриновая основа
пиримидиновое основание
Внутренняя сторона спирали
Пентоза
Рибоза (U)
Дезоксирибоза (Т)
Фосфорная кислота
Скелет спиральной цепи
Основная единица: нуклеотид
Краткая история
Мендель: эксперимент с горошком
Откройте для себя законы наследования: одна и та же пара факторов разделяется, а разные пары факторов свободно комбинируются.
Впервые предложены «генетические факторы» (т.е. гены).
Морган: Эксперименты с дрозофилой
гены в хромосомах
Наследственные генетические цепочки и закон обмена
Уотсон и Крик: модель структуры двойной спирали ДНК
Правосторонняя структура двойной спирали ДНК
Механизм репликации ДНК: полуконсервативная репликация.
Генная инженерия
Основа рождения
Три крупнейших теоретических открытия
Носителем генетической информации является ДНК, а не белок [Эксперимент по трансформации Pneumococcus pneumoniae]
Модель структуры двойной спирали молекулы ДНК и полуконсервативный механизм репликации
Центральная догма и теория операторов и расшифровка генетического кода
Теоретические основы
Базовая структура ДНК у всех организмов одинакова. Разные гены имеют одинаковую материальную основу, поэтому гены могут рекомбинироваться и заменяться местами.
Гены можно вырезать и переносить, что гарантирует возможность генной инженерии воздействовать на гены, не затрагивая их функции.
Генетический код универсален, и между полипептидами и генами существует соответствие независимо от вида.
Гены могут передавать генетическую информацию следующему поколению посредством репликации.
Три главных изобретения в технике
Технология разрезания и соединения молекул ДНК in vitro
Использование векторов генной инженерии
Сюй Лей анализ молекул ДНК, электрофорез в агаровом геле, технология гибридизации...
1937: Первый год генной инженерии.
концепция
Это относится к использованию ферментативных методов для рекомбинации гетерологичных генов и ДНК-носителя in vitro, и полученная рекомбинантная ДНК вводится в клетки-хозяева, так что гетерологичные гены могут быть реплицированы и экспрессированы в клетках-хозяевах, тем самым достигая трансформации реципиента. биологические виды или признаки и массовое производство. Производство биологических разновидностей и продуктов, необходимых человеку.
Также известен как: молекулярное клонирование или технология рекомбинантной ДНК.
основное содержание
Из генома биологического организма выделяют фрагмент ДНК, содержащий интересующий ген.
Экзогенный фрагмент ДНК, несущий целевой ген, соединяется с самореплицирующейся векторной молекулой с меткой селекции с образованием рекомбинантной молекулы ДНК.
Молекулы рекомбинантной ДНК переносятся в соответствующие клетки-реципиенты (клетки-хозяева) и размножаются вместе с ними.
Из большого количества популяций размножения клеток отбираются клетки-реципиенты, которые получили молекулы рекомбинантной ДНК, а также отбираются целевые гены, которые были амплифицированы.
Целевой ген клонируется в вектор экспрессии и вводится в клетки-хозяева, чтобы он мог достичь функциональной экспрессии на новом генетическом фоне и производить вещества, необходимые человеку.
основной процесс
Пять основных операционных блоков: резка, соединение, перенос, добавление и проверка.
Изолировать ДНК, содержащую интересующий ген
Ферменты рестрикции разрезают фрагменты ДНК (разрезают)
Плазмиду выделяют из E.coli и переваривают (переваривают)
Лигаза соединяет целевой ген и плазмиду для ферментативного переваривания (связана с: рекомбинацией ДНК)
Резка и сплайсинг: рекомбинация ДНК in vitro
Внедрить рекомбинантную плазмиду в клетку-хозяина (трансформировать).
Клонируйте интересующий ген и проверяйте экспрессию (амплификация и обнаружение).
Тест: Скрининг и идентификация трансформантов
Трансформация и амплификация: трансформация и амплификация молекул рекомбинантной ДНК.
Гены любого организма → любая другая рецепторная клетка, не имеющая к нему никакого отношения
Определенный сегмент ДНК → реплицируется в клетке-реципиенте → получают большое количество очищенных фрагментов ДНК.
Четыре элемента
Средство ферментное
Ген-мишень (препарат)
вектор гена
генный рецептор
ДНК
Классификация
хромосомная ДНК
Получить целевой ген
Плазмидная ДНК
перевозчик
Вирус, фаговая ДНК
Создание векторов клонирования, изолирование целевых генов и факторов регуляции экспрессии генов.
ДНК митохондриального хлоропласта
Получить целевой ген
извлекать
Подготовка биологических материалов
Богатое содержание ДНК с небольшим количеством примесей
Плазмидная ДНК
Бактериальная жидкая культура → поздняя логарифмическая фаза роста
ДНК растения
Молодые части или саженцы, уменьшают накопление крахмала/сахара → мешают экстракции ДНК
ДНК животных
Удаление участков с высокой активностью ферментов
лизированные клетки
Правильный лизис, чтобы избежать разрывов нитей ДНК
Прокариоты: лизоцим, ультразвук, NaOH, обработка SDS или кипячение, обработка замораживанием.
Эукариоты: раздавлены → то же, что и выше.
Изолировать и очистить ДНК
Клеточная жидкость после лизиса → + денатурант белка [фенол/хлороформ/изоамиловый спирт/ДСН...] (денатурация белка) → центрифугирование (удаление примесей, таких как белок) → органический растворитель [этанол/изопропиловый спирт] (агрегация и осаждение ДНК) → Удалить раствор → Сырая ДНК → Дальнейшая очистка [фенол/хлороформ: экстракция, 70% этанол]
Обнаружение: технология гель-электрофореза
принцип
мобильность
Скорость миграции электрофоретических молекул в электрическом поле
Пропорционален напряженности электрического поля и собственному чистому заряду.
Обратно пропорциональна коэффициенту трения диэлектрических молекул.
Сам остов ДНК заряжен отрицательно и движется к положительному электроду в электрическом поле;
Разные молекулярные массы и конфигурации ДНК различны → электрофоретическая подвижность различна → разные зоны.
Разделите компоненты смеси белков или молекул нуклеиновых кислот.
тип
электрофорез в агаровом геле
«Маленький, широкий»: степень разделения: плохая, диапазон разделения: лучше, чем;
полиакриламидный гель
Чем выше концентрация геля, тем меньше поры и выше разрешающая способность.
Средство ферментное
эндонуклеаза рестрикции
концепция
Субстрат: кольцевая или линейная двухцепочечная ДНК.
Распознавание: специальные нуклеотидные последовательности.
Разрыв: (соответствующие условия реакции) специфические фосфодиэфирные связи каждой цепи.
Продукция: фрагменты ДНК генов 3'-OH и 5'-P.
эндодезоксирибонуклеаза
тип
Фермент I типа
Сайт распознавания расположен далеко, произвольное расщепление, низкая специфичность, требуются кофакторы.
Фермент II типа ✓
Сайт узнавания: специфический сайт внутри или рядом с определенным сайтом, специфическое расщепление, сильная специфичность, последовательная последовательность узнавания и расщепления, нет необходимости в кофакторах или только Mg2.
Фермент III типа
Разрезая за пределами сайта узнавания, сайт узнавания представляет собой инвертированную повторяющуюся последовательность, нерегулярную и редко образует полностью вырезанные фрагменты.
Принципы именования
Состав: номер штамма, название штамма, последовательность выделения.
Первая буква названия рода пишется с заглавной буквы, первые две буквы названия вида — строчные, порядок разделения (латинские буквы)
Механизм
последовательность распознавания
Ферменты рестрикции могут распознавать специальные нуклеотидные последовательности двухцепочечной ДНК.
Одна и та же молекула коротка и имеет высокую вероятность появления.
Способ действия
Характеристики ферментативной резки
Длина распознавания
4~8 пар оснований
положение резки
Распознайте внутреннюю или обе стороны последовательности
Определить структуру
палиндром
Тип фермента
Редкий Дайсер
изошиаза
Последовательность распознавания та же.
Гомогеназа
Последовательности распознавания разные, но липкие концы получаются одинаковые.
Метод резки
Липкие концы (разрезы в шахматном порядке)
5-футовый липкий конец (5-футовый короткий)
3-футовый липкий конец (3-футовый короткий)
Плоские концы (обрезаны заподлицо)
реакционная система
Субстрат реакции (ДНК)
Дозировка эндонуклеазы (определяется по активности)
Реакционный буфер (оптимальный pH7,5)
Соответствующая температура (в основном 37 ℃)
Идентификация ферментативного расщепления: технология гель-электрофореза
ДНК-лигаза
концепция
Катализ: между соседними 3'-OH и 5'-P концами молекулы ДНК.
Образуется: фосфодиэфирная связь
То есть: закрыть одноцепочечный разрыв между соседними нуклеотидами двухцепочечной ДНК.
Существует два основных типа
E. coli-ДНК-лигаза
Липкий конец, требуется кофактор: НАД.
Один и тот же фермент рестрикции или два гомогенных фермента
Т4-ДНК-лигаза
Липкие концы, плоские концы, требуется кофактор: АТФ.
Один и тот же или два фермента рестрикции
Соединения с нелипкими и неплоскими концами
Экзонуклеаза
плоские концы
терминальная нуклеотидилтрансфераза
Модифицированы в дополнительные липкие концы.
щелочная фосфатаза
Измените 5'-P на 5'-OH, чтобы предотвратить самоциклизацию носителя.
Основные способы соединения ДНК
Гомологичная эндонуклеаза → липкий конец
Гомотайлаза → липкий конец
разные липкие концы
Вырезать ровно, заполнить плоско
Искусственные липкие концы – 5 торчащих концов.
Составьте уровень
Искусственные липкие концы – 3 торчащих конца.
Искусственные липкие концы – плоские концы.
Замена липких кончиков
Другие инструментальные ферменты
ДНК-полимераза
ПЦР-амплификация
обратная транскриптаза
Создать библиотеку кДНК
Полинуклеотидкиназа Т4
S1 нуклеаза
Подготовка целевого гена
целевой ген
концепция
☞Конкретный ген/фрагмент ДНК, который был/должен быть выделен, трансформирован, амплифицирован и экспрессирован, может кодировать определенный продукт/признак.
Также известен как: специальный ген или целевой ген.
источник
Геном эукариотических хромосом (человека и животного)
хромосомы прокариот
плазмида, вирус
Митохондрии, хлоропласты...
метод
Метод прямого разложения
принцип
Хромосомная ДНК → Эндонуклеаза рестрикции: Разрезать → Связать все фрагменты → Определенный вектор → Перенести в E. coli → Размножить → Скрининг с использованием соответствующих методов → Рекомбинантные колонии, содержащие целевой ген → Извлечь ДНК → Ферментативное расщепление → Получить целевой ген.
объект
Геномы прокариот небольшие, гены легко обнаружить или молекулы ДНК с известными нуклеотидными последовательностями.
преимущество
Быстро и легко, чистота продукта высокая. целевой ген
метод генной библиотеки
принцип
Вся генетическая информация генома определенного организма → вектор клонирования → хранилище: клоновая субпопуляция бактерий-реципиентов (геномная библиотека этого организма).
Группа бактерий-реципиентов, содержащая все гены генома определенного организма, называется: геномной библиотекой организма.
химический синтез
Когда информация о последовательности известна, это наиболее удобный способ получить целевой ген!
Метод ПЦР-амплификации (полимеразной цепной реакции)
вещество
Моделирование репликации ДНК in vitro in vivo
принцип
цикл
транссексуал
94℃
Нагревание/щелочное действие, двухцепочечная ДНК → разрыв водородной связи → одноцепочечная
отжиг
55℃
Ренатурация шаблона и праймера
продлевать
72℃
Конкретная последовательность DNS: геометрический экспоненциальный рост
Процесс реакции ПЦР/этапы реакции
Денатурация матричной ДНК
После того, как матричная ДНК нагревается до 94~95°C в течение определенного периода времени, двухцепочечная ДНК матричной ДНК или двухцепочечная ДНК, образовавшаяся в результате ПЦР-амплификации, диссоциируется на одну цепь, так что она может связываться с праймер и подготовка к следующему раунду реакции;
Отжиг (ренатурация) матричной ДНК и праймеров
После того, как ДНК-матрица нагревается и денатурируется в одну цепь, температура падает примерно до 55°C, и праймер соединяется с комплементарной последовательностью одноцепочечной ДНК-матрицы;
расширение праймера
Под действием ДНК-полимеразы Taq конъюгат ДНК-матрица-праймер использует dNTP в качестве исходного материала для реакции и целевую последовательность в качестве матрицы. В соответствии с принципами спаривания оснований и полуконсервативной репликации новая полуконсервативная цепь репликации комплементарна. к матричной цепи ДНК синтезируется.
Реакционная система ПЦР
реакционный буфер
Субстрат: dNTP (4 вида дезоксинуклеотидов: dATP, dGTP, dTT, dCTP)
Праймеры×2
Шаблон: молекула ДНК
Фермент Taq (ДНК-полимераза)
Mg2 (кофактор фермента)
ПЦР характеристики
высокая чувствительность
Сильная специфичность
Просто, быстро и воспроизводимо
Низкие требования к чистоте пробы
перевозчик
Понятие генного носителя
Инструменты или носители, которые вводят чужеродную ДНК или гены-мишени в соответствующие клетки-хозяева.
Перевозчик должен выполнить условия
Относительная молекулярная масса мала и подходит для получения целевого гена;
Он может осуществлять независимую и стабильную саморепликацию внутри клетки-хозяина и при этом сохранять стабильную репликацию и генетические характеристики при вставке чужеродной ДНК.
Он может предоставлять селектируемые маркеры для клеток-хозяев (рецепторов) и иметь идентифицируемые фенотипические характеристики для облегчения скрининга;
В последовательности ДНК имеется соответствующий единственный сайт разрезания эндонуклеазы рестрикции. Этот сайт расположен в несущественной области для репликации ДНК. То есть после разрезания определенной эндонуклеазой рестрикции плазмидная ДНК может закрываться и открываться для пропуска. Извлекайте фрагменты ДНК из источника, не теряя при этом свои собственные фрагменты.
Плазмида
концепция
Молекула ДНК с двойной спиралью замкнутого круга
Репликация и наследование не зависит от хромосом, а репликация и транскрипция зависит от ферментов и белков, кодируемых хозяином.
Против хромосом
Все, что связано с биологической генетикой
Химически разные
Хромосомы: белок и ДНК
Плазмида: ДНК
тип
Плотный тип
Существует только одна копия или, самое большее, несколько копий.
Расслабленный
Обычно используемые плазмидные векторы
Плазмидный вектор Escherichia coli
Два гена устойчивости к антибиотикам
Лактозный оперон: ген lacZ → β-галактозидаза → гидролиз X-gal (скрининг сине-белыми пятнами lacZ)
Экстракция плазмидной ДНК
селективное извлечение
В более мягких условиях для лизиса бактерий используют лизоцим, а полученные фрагменты клеток разделяют высокоскоростным центрифугированием из-за различий в относительной молекулярной массе между хромосомной ДНК и плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК с относительно небольшой молекулярной массой остается в супернатанте и осаждается этанолом для получения сырой плазмидной ДНК.
Щелочной метод SDS
Он избирательно денатурирует двухспиральную открытоцепочечную ДНК в хромосомах в диапазоне pH 12,0–12,5, оставляя при этом двухцепочечную ДНК с замкнутой петлей неизменной. После нейтрализации ацетатом натрия ДСН вызывает осаждение комплекса белок-ДСН и ДНК с высокой относительной молекулярной массой, а затем плазмидную ДНК оставляют в супернатанте посредством высокоскоростного центрифугирования для разделения.
Очистка плазмидной ДНК
Щелочное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы
Хромосомная двойная спиральная ДНК с открытой цепью легко денатурируется, тогда как двухцепочечная плазмидная ДНК с замкнутым кольцом денатурируется нелегко. В градиенте концентрации сахарозы плазмидная ДНК оседает быстрее, чем денатурированная ДНК, и ее отделяют и очищают.
Метод центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия-этидия бромида (Et-Br).
Открытоцепочечная ДНК двойной спирали хромосомы легко соединяется с красителем Et-Br и ее плотность снижается. Плазмидная ДНК не пригодна для связывания, поскольку плотно закрыта, а плотность высока, поэтому она высока. отделяют центрифугированием.
Метод нитроцеллюлозной мембранной адсорбции
Нитроцеллюлозная мембрана адсорбирует одноцепочечную ДНК, а хромосомная ДНК легко денатурируется с образованием одноцепочечной ДНК, которая отделяется от плазмидной ДНК.
Трансформируйте и стройте
Удалите несущественные области
Добавить новые гены-маркеры
Ввести последовательности ДНК с несколькими сайтами узнавания и расщепления ферментами рестрикции, то есть несколькими сайтами клонирования.
лямбда-фаг
Фаг
Он не может воспроизводиться независимо от клеток-хозяев, может расти только в живых клетках и строго специфичен для клеток-хозяев.
Основные типы
вставить вектор
вектор замены
Другие перевозчики
генетическая рекомбинация
концепция
Целевой ген и вектор: комбинация in vitro → рекомбинантный.
Метод реорганизации
В основном липкие концы
прямое соединение
Просто и эффективно
Добавьте соединение хвоста
Использование терминальной нуклеотидилтрансферазы для создания липких концов на концах ДНК.
Основной инструментальный фермент: Т4-ДНК-лигаза (5'-P и 3'-OH)
рекомбинация ДНК
① Лигирование липких концов, производимое одной и той же эндонуклеазой.
② Лигирование липких концов, производимое гомозиготными ферментами.
③Соединение разных липких концов
④Соединение искусственных липких концов (выступающий конец 5 футов, выступающий конец 3 дюйма, плоский конец)
⑤ Замена липкого конца
Скорость рекомбинации = индекс тяжелых компонентов, содержащих экзогенную ДНК / количество векторных молекул, обычные условия эксперимента: 25 ~ 75%
Трансформация и экспрессия генов
Целевой ген вводится в клетки-реципиенты
Клетка-хозяин (рецепторная клетка)
концепция
Клетки, получающие ДНК чужеродного гена во время трансформации, трансдукции и гибридизации.
является рекомбинантным сайтом амплификации
тип
прокариотические клетки
Escherichia coli, Bacillus subtilis
эукариотические клетки
Дрожжи (основные)
Функции
Одноклеточный
Непатогенный, безопасный
Компетентность
Компетентность
Клетки-хозяева могут поглощать экзогенные молекулы ДНК и эффективно действовать как рецепторы трансформации в определенных физиологических состояниях.
в зависимости от
Физиологическое состояние самой рецепторной клетки
Конфигурация и размер молекул рекомбинантной ДНК
Общие клетки-хозяева в фазе логарифмического роста: способность к трансформации Макс.
компетентные клетки
Клетки в физиологическом состоянии способны поглощать внешние молекулы ДНК.
Конвертировать
Са2-индуцированная трансформация интактных бактериальных клеток
электропорационная трансформация
Коэффициент конверсии
концепция
Влияющие факторы
амплификационный скрининг
усиливать
Метод скрининга
Скрининг на основе векторных генов устойчивости к антибиотикам и соответствующих выбранных лекарств
Способ скрининга трансформации Escherichia coli плазмидным вектором, несущим двойные маркеры устойчивости к антибиотикам
Носитель: Amp (резистентный к ампициллину), Tet (устойчивый к тетрациклину)
Чужеродный ген встраивается в один из генов устойчивости к антибиотикам, вызывая его инактивацию.
Две чашки с антибиотиками для скрининга рекомбинантов
шаг
①Положительный выбор
Содержит антибиотики, соответствующие невстроенным инактивированным генам устойчивости.
Трансформант√
Трансформант, содержащий плазмиду, содержащую целевой ген √
Трансформант, содержащий рекомбинантный ген-мишень √
Нетрансформант ×
②Отрицательный выбор
Антибиотики, содержащие инсерционно инактивированные гены устойчивости
Нерекомбинантные трансформанты, не содержащие целевой ген√
Трансформант, содержащий рекомбинантный ген-мишень ×
Сравнение двух сред → Отбор: Трансформанты, содержащие рекомбинанты генов-мишеней.
Скрининг с использованием гена lacZ лактозного оперона (сине-белое пятно)
Бактерии с полным лактозным опероном могут транслировать ген LacZ, кодирующий β-галактозидазу → гидролизовать X-gal → синий цвет.
Вставка чужеродного гена → ген LacZ не может экспрессироваться → белый
Обязательно: инактивированный ген устойчивости к антибиотикам не вставлен → культуральная среда с ампициллином.
Трансформант, содержащий плазмиду, содержащую целевой ген: штамм синий
Трансформант, содержащий рекомбинантный целевой ген: штамм белый
Применение ДНК-чипа для идентификации рекомбинантов
Множество специфических ДНК-олигонуклеотидов/фрагментов ДНК (зондов) → фиксировано: заданное положение чипа
Образец для тестирования: метка → гибридизация с чипом (принцип комплементарного спаривания оснований) → обнаружение сигнала гибридизации и компьютерный анализ.
Скрининг на основе продуктов трансляции целевых генов (белков, ферментов, полипептидов) [Нет маркерного гена или невозможно синтезировать зонд]
электрофорез в белковом геле
СТРАНИЦА
Иммуноанализ
ИФА
Вестерн-блоттинг
Иммунопреципитация
твердофазный радиоиммуноанализ
Экспрессия целевого гена
Применение в пищевой промышленности: генетически модифицированные продукты.
генетически модифицированная микробная пища
определение
Инженерные бактерии
Функции
приложение
(1) Улучшение качества пищевых продуктов
(2) Упростить производственный процесс и сократить производственный цикл.
(3) Антибактериальная и антисептическая консервация пищевых продуктов.
(4) Улучшение бактерий, производящих пищевые ферменты.
(5) Производство функциональных ингредиентов для здорового питания
(6) Быстрое обнаружение пищевых микроорганизмов
генетически модифицированные продукты животного происхождения
Задействованные типы
основное приложение
Изменить скорость появления скота;
Улучшите питательный состав молочных продуктов, особенно для детей грудного и раннего возраста.
Производство белков сыворотки крови человека и т.д. с помощью биореакторов.
генетически модифицированные растительные продукты
определение
тип
приложение
Улучшить качество пищевых ингредиентов
Улучшить процессы производства продуктов питания
Производство пищевых добавок и функциональных продуктов питания