Wondershare EdrawMind
Галерея диаграмм связей Биология. Глава 2. Ферменты как инструменты генной инженерии. Интеллект-карта.
- 3
Биология. Глава 2. Ферменты как инструменты генной инженерии. Интеллект-карта.
Это интеллектуальная карта инструментальных ферментов генной инженерии из главы 2 биологии. Структура курса генной инженерии включает свойства и характеристики инструментальных ферментов.
Отредактировано в 2023-11-16 23:39:36
Биология. Глава 2. Ферменты как инструменты генной инженерии. Интеллект-карта.
- Рекомендовано вам
- Структура
Глава 2. Ферменты-инструменты для генной инженерии
эндонуклеаза рестрикции
Функция: Распознавание специфических последовательностей в молекулах двухцепочечной ДНК и разрезание двухцепочечной ДНК (в основном встречается у прокариотических бактерий, помогая бактериям ограничить вторжение чужеродной ДНК).
Система модификации рестрикции (система защиты бактерий)
Ограничение: это означает, что определенные типы бактерий могут уничтожать вторгающуюся чужеродную ДНК посредством действия эндонуклеаз рестрикции, тем самым ограничивая вторжение чужеродной ДНК в биологические клетки.
Модификация: собственные молекулы ДНК биологической клетки метилируются в определенных положениях оснований под действием метилазы, которая может защитить их от повреждения собственными эндонуклеазами рестрикции.
Эндонуклеаза рестрикции типа II
Основные характеристики
Распознавать специфические последовательности из 4–8 пар оснований в двухцепочечных молекулах ДНК.
Сайты расщепления большинства ферментов находятся внутри или по обе стороны от последовательности узнавания.
Определите последовательность расщепления как классическую ротационно-симметричную структуру-палиндром.
Расщепляет ДНК с образованием концов, содержащих 5'-фосфатные и 3'-гидроксильные группы.
Смещенные разрезы дают липкие концы, разрезы вдоль оси симметрии дают плоские концы.
Действие ферментативной реакции
Большинство ферментов типа II требуют сходных условий реакции.
Мультиферментный комбинированный ферментативный гидролиз
В принципе, ферменты, которым требуется одинаковая концентрация соли, могут перевариваться одновременно, но места расщепления ферментов не могут перекрываться.
Ферменты с различными требованиями к концентрации соли
Используйте концентрацию соли, необходимую для более дорогих ферментов, увеличьте дозировку более дешевых ферментов и одновременно ферментативно гидролизуйте.
Фермент с низким содержанием соли сначала разрезает его, затем добавляет соль, а фермент с высоким содержанием соли разрезает его снова.
Сначала разрезает один фермент, затем меняют буфер, и снова разрезает другой фермент.
Факторы, влияющие на активность ферментов
1||| Чистота образца ДНК
Примеси: белок, фенол, хлороформ, этанол, ЭДТА, ДСН, NaC и др.
Подход
Увеличьте количество фермента: 10 ЕД фермента на 1 мкг ДНК.
Увеличение общего объема реакции
Увеличьте время реакции
2||| Уровень метилирования образцов ДНК: Метилирование определенных нуклеотидов в последовательности узнавания сильно ограничивает активность фермента.
3||| Молекулярная структура ДНК
Некоторым эндонуклеазам рестрикции требуется во много раз больше ферментов для расщепления сверхспиральной плазмидной ДНК или вирусной ДНК, чем для расщепления линейной ДНК.
Некоторые эндонуклеазы рестрикции нуклеиновых кислот разрезают сайты рестрикции ферментов в разных положениях, и их эффективность также существенно различается.
4||| Буферные свойства эндонуклеаз: высокие концентрации ферментов, высокие концентрации глицерина, низкая ионная сила, крайние значения рН и т. д. обуславливают низкую специфичность распознавания и расщепления последовательностей некоторых эндонуклеаз, т. е. звездчатую активность.
5||| Температура реакции переваривания: Стандартная температура реакции для большинства эндонуклеаз рестрикции составляет 37°C.
Прекращение ферментативной реакции рестрикции
Большинство ферментов: теплая ванна при 65°C в течение 5 минут.
Некоторые термостабильные ферменты (такие как BamH Ⅰ и Hae Ⅱ): добавьте раствор реакции терминации (добавьте 0,5 моль/л ЭДТА, чтобы конечная концентрация в растворе достигла 10 ммоль/л для хелатирования Mg2)
приложение
Разрезает ДНК в определенных участках с образованием определенных фрагментов фермента рестрикции.
Расщепление рестриктазами приводит к образованию идентичных липких концов для рекомбинации.
Создайте рестрикционную карту ДНК
Создать генную библиотеку
Саузерн-блоттинг
Этапы переваривания ДНК (переваривание 0,2–1,0 мкг ДНК)
Добавьте соответствующий объем раствора ДНК
Добавьте 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера для расщепления рестриктазами и перемешайте.
Добавьте 1-2 ЕД фермента рестрикции и перемешайте.
Поместите вышеуказанные смешанные реагенты при соответствующей температуре и инкубируйте в течение необходимого времени.
Добавьте 0,5 моль/л
ДНК-полимераза
характеристика
ДНК-полимераза I Escherichia coli (ДНК pol I)
активный
5'->3' ДНК-полимеразная активность
5'->3' экзонуклеазная активность
3'->5' экзонуклеазная активность
Основное использование
Трансляция ника: активность 5'->3'-экзонуклеазы и полимеразы работает вместе, чтобы продвигать ник.
Приготовление ДНК-зондов, меченных 32P.
Большой фрагмент ДНК-полимеразы I Escherichia coli (фермент Кленова)
основные свойства
Источник: ДНК-полимераза Escherichia coli Ⅰ обрабатывается субтилизином для получения N-концевой трети большого пептидного сегмента, который представляет собой фермент Кленова.
Обладает 5'->3' ДНК-полимеразной активностью. Обладает 3'->5'-экзонуклеазной активностью. Потеря активности 5'->3' экзонуклеазы
Основное использование
1||| Заполните 5'-липкие концы, генерируемые эндонуклеазами.
2||| Изотопная концевая маркировка фрагментов ДНК
3||| Синтез второй цепи кДНК
4||| Определение последовательности ДНК методом терминации концов дидезоксицепи
Т4-ДНК-полимераза
Основные характеристики
① Активность 5'->3' ДНК-полимеразы ② 3'->5' экзонуклеолитическая полимеразная активность ③ Отсутствие 5'->3' экзонуклеазной активности. ④ В отсутствие dNTP экзорасщепление может быть выполнено с любого 3'-OH-конца. ⑤ Когда существует только один вид dNTP, экзолиз прекращается, когда подвергается воздействию комплементарный нуклеотид. ⑥ При наличии всех четырех дНТФ преобладает полимеризационная активность.
Основное использование
①Отрежьте 3'-липкий конец, генерируемый эндонуклеазой.
② Мечение изотопных концов фрагментов ДНК
ДНК-полимераза бактериофага Т7
Основные характеристики
① Активность 5'->3' ДНК-полимеразы ② 3'->5' экзонуклеазная активность ③ Имеет самую сильную процессивность среди известных ДНК-полимераз. ④ После модификации он становится ферментом, секвенирующим длинные фрагменты ДНК с использованием метода обрыва дидезоксицепи.
Основное использование
Реакции удлинения праймера для более длинных фрагментов ДНК
Быстрая концевая маркировка посредством реакций заполнения или обмена (замещения)
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT)
Основные характеристики
Источник: тимус теленка.
ДНК-полимераза без матрицы случайным образом включает dTNP на 3'-OH-конце.
Основное использование
Добавьте комплементарные хвосты гомополимера к вектору или целевой ДНК.
Изотопное мечение 3'-концов фрагментов ДНК
РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза)
Основные характеристики
(1) синтез кДНК под руководством РНК
(2) Двунаправленное вырезание цепи РНК в гибридной цепи ДНК-РНК (активность РНКазы H)
(3) Активность полимеризации ДНК под контролем ДНК
Часто используемая обратная транскриптаза
AMV: фермент обратной транскриптазы, полученный из очищенного вируса миелобластомы птиц (функционирует при 42°C).
MMLV: продукт экспрессии гена обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV) в E. coli (функционирует при 37°C).
Основное использование
Транскрибируйте РНК эукариотических генов в ДНК и создайте библиотеку кДНК.
Оцените и пометьте 3'-конец фрагментов ДНК с 5'-концами и подготовьте зонды.
Заменяет фрагмент Кленова для секвенирования ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза (фермент Taq)
Термическая стабильность
ионная зависимость
Плохая точность: обладает 5'->3'-полимеразной активностью и 5'->3'-экзонуклеазной активностью; Но корректирующей активности 3'->5' нет, и в конец синтезированного расчетного фрагмента будет добавлен дополнительный аденилат А.
Фермент, модифицирующий нуклеиновую кислоту
Т4-полинуклеотидкиназа (Т4-ПНК)
Характеристики: Катализирует перенос γ-фосфатной группы АТФ на 5'-ОН-конец ДНК или РНК.
Назначение: используется для изотопной маркировки концов зондов.
Щелочная фосфомоноэстераза: удаляет 5'-фосфатные группы из ДНК и РНК.
Функция: Катализирует удаление 5'-фосфатной группы из молекул нуклеиновой кислоты, тем самым превращая 5'-P-конец фрагмента ДНК или РНК в 5'-OH-конец. Его роль в молекулярном клонировании заключается в предотвращении самолигирования между ними. липкие концы.
Основное использование
Удалите 5'-концевую фосфатную группу векторной ДНК, чтобы предотвратить циклизацию вектора и повысить скорость рекомбинации.
Удалить 5'-фосфатные группы из ДНК и РНК, затем пометить концы полинуклеотидкиназой Т4.
Щелочная фосфомоноэстераза тимуса теленка (CIP): инактивируется при 68°C.
Основная фосфатмоноэфирная связь E. coli (BAP): стабильна при 68 ° C и устойчива к экстракции фенолом.
Одноцепочечная экзонуклеаза: экзонуклеаза VII (ExoVII)
двухцепочечная экзонуклеаза
Экзонуклеаза III (ExoIII)
Лямбда-экзонуклеаза (λExo)
Одноцепочечная эндонуклеаза: нуклеаза S1.
Основные характеристики: Из Aspergillus oryzae. ① Объяснение одноцепочечной ДНК происходит в 75 000 раз быстрее, чем объяснение двухцепочечной ДНК. ② Требуется Zn2 ③ Оптимальный диапазон oH: 4,0–4,3. ④ Требуется NaCl: 10~300 ммоль/л.
Основная реакция
① Эндокуция одноцепочечной ДНК или РНК.
② Двухцепочечная ДНК или РНК с разрывами или трещинами внутри.
важное использование
① Удалите одноцепочечный выступ фрагмента ДНК и сделайте его тупым концом. ② Удалить шпильку, образовавшуюся во время синтеза кДНК. ③ Анализ количества мРНК с помощью эксперимента по защите от нуклеазы S1. ④ Гибридизация зрелой мРНК и геномной ДНК в сочетании с гидролизом этим ферментом позволяет локализовать интроны. ⑤ Обрезать концы прогрессивных делеционных мутаций.
Одноцепочечная эндо-двухцепочечная экзонуклеаза: нуклеаза Bal31.
Основные характеристики
ДНК-лигаза
Часто используемые ферменты
ДНК-лигаза Escherichia coli: использование НАД+ [никотинамидадениндинуклеотида] в качестве кофактора
Бактериофаг Т4 Лигаза Т4: использует АТФ [аденозинтрифосфат] в качестве кофактора.
Тот же механизм действия
основные свойства
Восстанавливает фосфодиэфирные связи в разрывах двухцепочечной ДНК.
Восстанавливает фосфодиэфирную связь в разрыве цепи ДНК, связанной с цепью РНК.
Соедините двухцепочечные молекулы ДНК с тупыми концами.
Условия реакции
Липкие концевые соединения
Плоское торцевое соединение
Прямое лигирование с использованием ДНК-лигазы Т4.
Сожитель плюс хвостовое соединение
Подключайтесь с помощью разъемов
Лигирование адаптера ДНК