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Galeria de mapas mentais Engenharia genética
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Engenharia genética
Este é um mapa mental sobre engenharia genética, com uma introdução detalhada e uma descrição abrangente. Espero que possa ser útil para amigos interessados.
Editado em 2023-11-24 01:34:49
- Anévrisme intracrânien
Il s'agit d'une carte mentale sur les anévrismes intracrâniens, avec le contenu principal, notamment: le congé, l'évaluation d'admission, les mesures infirmières, les mesures de traitement, les examens auxiliaires, les manifestations cliniques et les définitions.
- Entretien de la comptabilité des coûts
Il s'agit d'une carte mentale sur l'entretien de comptabilité des coûts, le principal contenu comprend: 5. Liste des questions d'entrevue recommandées, 4. Compétences de base pour améliorer le taux de réussite, 3. Questions professionnelles, 2. Questions et réponses de simulation de scénarios, 1. Questions et réponses de capacité professionnelle.
- Méthode de recherche de littérature
Il s'agit d'une carte mentale sur les méthodes de recherche de la littérature, et son contenu principal comprend: 5. Méthode complète, 4. Méthode de traçabilité, 3. Méthode de vérification des points, 2. Méthode de recherche inversée, 1. Méthode de recherche durable.
Engenharia genética
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- Descrição
Engenharia genética
Gene
conceito
Uma sequência de nucleotídeos específica que tem efeito genético na molécula de DNA
Orientar a síntese de substâncias importantes como proteínas no corpo humano e manter as funções fisiológicas normais do corpo humano.
Nível material: uma sequência de ácido desoxirribonucléico (DNA) em um cromossomo.
Nível funcional: portador de informação genética, codificando funções moleculares de proteínas e ácidos ribonucleicos (RNA) e regulando a expressão gênica.
ácido nucleico
Classificação
ADN (ADN)
Núcleo, mitocôndrias, cloroplastos, plasmídeos...
portador de informação genética
ARN (ARN)
Citoplasma, núcleo
Classificação
RNA ribossômico (rRNA)
componentes dos ribossomos
RNA de transferência (tRNA)
transportar aminoácidos
RNA mensageiro (mRNA)
Transmitir informações genéticas do DNA e orientar a síntese de proteínas
componentes químicos
Composição do elemento: C, H, O, N, P
Composição molecular:
base
base de purina
base de pirimidina
O lado interno da espiral
Pentose
Ribose (U)
Desoxirribose (T)
Ácido fosfórico
O esqueleto da cadeia espiral
Unidade básica: nucleotídeo
Uma breve história
Mendel: o experimento da ervilha
Descubra as leis da herança: o mesmo par de fatores é separado e os diferentes pares de fatores são combinados livremente
Propostos pela primeira vez "fatores genéticos" (isto é, genes)
Morgan: experimentos com Drosophila
genes nos cromossomos
Cadeias genéticas herdadas e lei da troca
Watson & Crick: modelo de estrutura de dupla hélice do DNA
Estrutura de dupla hélice destro do DNA
Mecanismo de replicação do DNA: replicação semiconservativa
Engenharia genética
A base do nascimento
Três grandes descobertas teóricas
O portador da informação genética é o DNA, não a proteína [experimento de transformação de Pneumococcus pneumoniae]
Modelo de estrutura de dupla hélice da molécula de DNA e mecanismo de replicação semiconservador
Dogma Central e Teoria do Operador e Decodificação do Código Genético
Base teórica
A estrutura básica do DNA em todos os organismos é a mesma. Diferentes genes têm a mesma base material, portanto os genes podem ser recombinados e trocados.
Os genes podem ser cortados e transferidos, garantindo que a engenharia genética possa operar nos genes sem afetar as suas funções.
O código genético é universal e existe uma correspondência entre polipeptídeos e genes, independentemente da espécie.
Os genes podem transmitir informações genéticas para a próxima geração por meio da replicação.
Três grandes invenções em tecnologia
Tecnologia de corte e união in vitro de moléculas de DNA
Uso de vetores de engenharia genética
Análise Xu Lei de moléculas de DNA, eletroforese em gel de ágar, tecnologia de hibridização...
1937: O primeiro ano da engenharia genética
conceito
Refere-se ao uso de métodos enzimáticos para recombinar genes heterólogos e DNA transportador in vitro, e o DNA recombinante resultante é introduzido nas células hospedeiras, de modo que os genes heterólogos possam ser replicados e expressos nas células hospedeiras, conseguindo assim a transformação do receptor. espécies ou características biológicas e produção em massa. Produzir variedades e produtos biológicos necessários aos seres humanos,
Também conhecida como: clonagem molecular ou tecnologia de DNA recombinante.
conteúdo principal
Do genoma de um organismo biológico, isola-se o fragmento de DNA que contém o gene de interesse.
O fragmento de DNA exógeno que transporta o gene alvo é conectado a uma molécula vetorial auto-replicante com uma marca de seleção para formar uma molécula de DNA recombinante.
As moléculas de DNA recombinante são transferidas para células receptoras apropriadas (células hospedeiras) e propagadas com elas.
A partir de um grande número de populações de propagação celular, as células receptoras que obtiveram as moléculas de DNA recombinante são examinadas e os genes alvo que foram amplificados são eliminados.
O gene alvo é clonado em um vetor de expressão e introduzido nas células hospedeiras para que possa atingir a expressão funcional sob um novo contexto genético e produzir substâncias necessárias aos humanos.
processo básico
Cinco unidades operacionais básicas: corte, conexão, transferência, adição e inspeção
Isole o DNA contendo o gene de interesse
Enzimas de restrição cortam fragmentos de DNA (corte)
O plasmídeo é isolado de E. coli e digerido (digerido)
A ligase conecta o gene alvo e o plasmídeo para digestão enzimática (conectada a: recombinação de DNA)
Corte e emenda: recombinação in vitro de DNA
Introduzir o plasmídeo recombinante na célula hospedeira (transformar)
Clone o gene alvo e rastreie a expressão (amplificação e detecção)
Teste: Triagem e identificação de transformantes
Transformação e amplificação: transformação e amplificação de moléculas de DNA recombinante
Genes de qualquer organismo → qualquer outra célula receptora que não tenha nada a ver com isso
Um determinado segmento de DNA → replicado na célula receptora → prepara um grande número de fragmentos de DNA purificados
Quatro elementos
Enzima ferramenta
Gene alvo (preparação)
vetor genético
receptor genético
ADN
Classificação
DNA cromossômico
Obtenha o gene alvo
DNA plasmídico
operadora
Vírus, fago DNA
Construir vetores de clonagem, isolar genes alvo e fatores reguladores de expressão gênica
DNA do cloroplasto mitocondrial
Obtenha o gene alvo
extrair
Preparando materiais biológicos
Rico conteúdo de DNA com poucas impurezas
DNA plasmídico
Cultura líquida bacteriana → fase de crescimento logarítmico tardio
ADN vegetal
Partes jovens ou mudas, reduzem o acúmulo de amido/açúcar → interferem na extração de DNA
ADN animal
Remova áreas com alta atividade enzimática
células lisadas
Lise adequada para evitar quebras na cadeia de DNA
Procariontes: lisozima, ultrassom, NaOH, tratamento com SDS ou tratamento com fervura e congelamento
Eucariontes: Esmagado → Igual ao anterior
Isolar e purificar DNA
Fluido celular após lise → + desnaturante de proteína [fenol/clorofórmio/álcool isoamílico/SDS...] (desnaturação de proteína) → centrifugação (remoção de impurezas como proteínas) → solvente orgânico [etanol/álcool isopropílico] (agregação e precipitação de DNA) → Remover solução → DNA bruto → Purificação adicional [fenol/clorofórmio: extração, etanol 70%]
Detecção: tecnologia de eletroforese em gel
princípio
mobilidade
Velocidade de migração de moléculas eletroforéticas em um campo elétrico
Proporcional à intensidade do campo elétrico e à sua própria carga líquida
Inversamente proporcional ao coeficiente de atrito das moléculas dielétricas
A própria espinha dorsal do DNA tem carga negativa e se move em direção ao eletrodo positivo no campo elétrico;
Diferentes pesos moleculares e configurações de DNA são diferentes → a mobilidade eletroforética é diferente → diferentes zonas.
Separe os componentes de uma mistura de proteínas ou moléculas de ácido nucleico.
tipo
eletroforese em gel de ágar
"Pequeno, largo": grau de separação: ruim; faixa de separação: melhor que
gel de poliacrilamida
Quanto maior a concentração do gel, menores serão os poros e mais forte será o poder de resolução.
Enzima ferramenta
endonuclease de restrição
conceito
Substrato: DNA de fita dupla circular ou linear
Reconhecimento: Sequências especiais de nucleotídeos
Quebra: (condições de reação apropriadas) ligações fosfodiéster específicas de cada cadeia
Produzir: fragmentos de DNA dos genes 3'-OH e 5'-P
endodesoxirribonuclease
tipo
Enzima tipo I
O local de reconhecimento está distante, clivagem arbitrária, baixa especificidade, requer cofatores
Enzima tipo II ✓
Local de reconhecimento: local específico dentro/próximo ao local definido, clivagem específica, forte especificidade, reconhecimento consistente e sequência de clivagem, sem necessidade de cofatores ou apenas Mg2
Enzima tipo III
Cortando fora do local de reconhecimento, o local de reconhecimento é uma sequência de repetição invertida, irregular e raramente produz fragmentos completamente cortados
Princípios de nomenclatura
Composição: número da cepa, nome da cepa, sequência de isolamento
A primeira letra do nome do gênero é maiúscula, as duas primeiras letras do nome da espécie são minúsculas e a ordem de separação (letras romanas)
Mecanismo
sequência de reconhecimento
As enzimas de restrição podem reconhecer sequências de nucleotídeos especiais em DNA de fita dupla.
A mesma molécula é curta e tem alta probabilidade de ocorrência.
Modo de ação
Características de corte enzimático
Duração do reconhecimento
4~8 pares de bases
posição de corte
Reconhecer o interior ou ambos os lados da sequência
Identificar estrutura
palíndromo
Tipo de enzima
Dicer Raro
isosquíase
A sequência de reconhecimento é a mesma
Homogenase
As sequências de reconhecimento são diferentes, mas as mesmas extremidades adesivas são obtidas
Método de corte
Extremidades pegajosas (cortes escalonados)
Extremidade adesiva de 5' (5' curta)
Extremidade adesiva de 3' (3' curta)
Extremidades planas (corte rente)
sistema de reação
Substrato de reação (DNA)
Dosagem de endonuclease (determinada pela atividade)
Tampão de reação (pH ideal 7,5)
Temperatura apropriada (principalmente 37℃)
Identificação da digestão enzimática: tecnologia de eletroforese em gel
DNA ligase
conceito
Catálise: entre as extremidades adjacentes 3'-OH e 5'-P da molécula de DNA
Formado: ligação fosfodiéster
Isto é: selar a lacuna de fita simples entre nucleotídeos adjacentes no DNA de fita dupla.
Existem dois tipos principais de
E. coli-DNA ligase
Extremidade pegajosa, requer cofator: NAD
A mesma enzima de restrição ou duas enzimas homogêneas
Ligase T4-DNA
Extremidades pegajosas, extremidades planas, requerem cofator: ATP
A mesma ou duas enzimas de restrição
Conexões com extremidades não pegajosas e não planas
exonuclease
extremidades planas
nucleotidil transferase terminal
Modificado em extremidades adesivas complementares
fosfatase alcalina
Modifique 5'-P para 5'-OH para evitar a autociclização do transportador
Os principais métodos de conexão do DNA
Endonuclease homóloga → extremidade pegajosa
Homotailase→extremidade pegajosa
extremidades adesivas diferentes
Corte plano, preencha plano
Extremidades adesivas artificiais - 5 pontas salientes
Faça o nível
Extremidades adesivas artificiais - 3 pontas salientes
Extremidades pegajosas artificiais - pontas planas
Substituição de pontas adesivas
Outras enzimas de ferramentas
DNA polimerase
Amplificação por PCR
transcriptase reversa
Construir biblioteca de cDNA
Polinucleotídeo quinase T4
Nuclease S1
Preparação do gene alvo
gene alvo
conceito
☞Um gene/fragmento de DNA específico que foi/está sendo isolado, transformado, amplificado e expresso, pode codificar um determinado produto/característica
Também conhecido como: gene especial ou gene alvo
fonte
Genoma dos cromossomos eucarióticos (humanos e animais)
cromossomos procariontes
plasmídeo, vírus
Mitocôndrias, cloroplastos...
método
Método de decomposição direta
princípio
DNA cromossômico → Endonuclease de restrição: Cortar → Vincular todos os fragmentos → Um determinado vetor → Transferir para E. coli → Propagar → Triagem com métodos apropriados → Colônias recombinantes contendo o gene alvo → Extrair DNA → Digestão enzimática → Obter o gene alvo.
objeto
Os genomas procarióticos são pequenos, os genes são fáceis de localizar ou moléculas de DNA com sequências de nucleotídeos conhecidas.
vantagem
Rápido e fácil, a pureza do produto é alta. gene alvo
método de biblioteca genética
princípio
Toda a informação genética do genoma de um determinado organismo → vetor de clonagem → armazenamento: uma subpopulação clone de bactérias receptoras (a biblioteca genômica deste organismo).
O grupo de bactérias receptoras que contém todos os genes do genoma de um determinado organismo é denominado: biblioteca genômica do organismo
síntese química
Quando a informação da sequência é conhecida, é a forma mais conveniente de obter o gene alvo!
Método de amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase)
substância
Simulação in vitro da replicação de DNA in vivo
princípio
ciclo
transexual
94℃
Aquecimento/alcalino, fita dupla de DNA → quebra da ligação de hidrogênio → fita simples
anelamento
55℃
Renaturalização de modelo e primer
ampliar
72℃
Sequência DNS específica: crescimento exponencial geométrico
Processo de reação PCR/etapas de reação
Desnaturação do modelo de DNA
Depois que o DNA modelo é aquecido a 94 ~ 95 ° C por um certo período de tempo, o DNA de fita dupla do DNA modelo ou o DNA de fita dupla formado pela amplificação por PCR é dissociado em uma fita única para que possa se ligar a o primer e prepare-se para a próxima rodada de reação;
Recozimento (renaturação) de DNA modelo e primers
Depois que o DNA molde é aquecido e desnaturado em uma fita simples, a temperatura cai para cerca de 55°C, e o primer emparelha com a sequência complementar da fita simples do DNA molde;
extensão de primer
Sob a ação da Taq DNA polimerase, o conjugado molde-iniciador de DNA usa dNTP como matéria-prima da reação e a sequência alvo como molde. De acordo com os princípios de emparelhamento de bases e replicação semiconservativa, uma nova fita de replicação semiconservativa complementar. para a fita modelo de DNA é sintetizada.
Sistema de reação PCR
tampão de reação
Substrato: dNTP (4 tipos de desoxinucleotídeos: dATP, dGTP, dTT, dCTP)
Primers×2
Modelo: molécula de DNA
Enzima Taq (DNA polimerase)
Mg2 (cofator enzimático)
Características de PCR
alta sensibilidade
Especificidade forte
Simples, rápido e reproduzível
Baixos requisitos para pureza da amostra
operadora
O conceito de portador de gene
Ferramentas ou transportadores que introduzem DNA estranho ou genes alvo em células hospedeiras apropriadas
A transportadora deverá cumprir as condições
A massa molecular relativa é pequena e adequada para receber o gene alvo;
Ele pode realizar auto-replicação independente e estável dentro da célula hospedeira e ainda pode manter replicação estável e características genéticas quando DNA estranho é inserido.
Pode fornecer marcadores selecionáveis para células hospedeiras (receptores) e possuir características fenotípicas identificáveis para fácil triagem;
Existe um único sítio de corte da endonuclease de restrição apropriado em sua sequência de DNA. Este sítio está localizado na região não essencial para a replicação do DNA. Ou seja, após ser cortado por uma determinada endonuclease de restrição, o DNA do plasmídeo pode ser fechado e aberto para aceitar. matéria estranha. Obtenha fragmentos de DNA sem perder seus próprios fragmentos.
Plasmídeo
conceito
Molécula de DNA de círculo fechado de dupla hélice
É independente dos cromossomos para replicação e herança e depende de enzimas e proteínas codificadas pelo hospedeiro para replicação e transcrição.
Cromossomos vs.
Tudo relacionado à genética biológica
Quimicamente diferente
Cromossomos: Proteína e DNA
Plasmídeo: DNA
tipo
Tipo apertado
Existe apenas uma cópia, ou no máximo existem apenas algumas cópias.
Descontraído
Vetores plasmídicos comumente usados
Vetor plasmídico de Escherichia coli
Dois genes de resistência a antibióticos
Operon lactose: gene lacZ → β-galactosidase → hidrólise X-gal (triagem de mancha azul-branca lacZ)
Extração de DNA plasmidial
extração seletiva
Sob condições mais brandas, a lisozima é usada para lisar bactérias, e os fragmentos celulares resultantes são separados por centrifugação em alta velocidade devido às diferenças no peso molecular relativo entre o DNA cromossômico e o DNA plasmídico. O ADN plasmídico com um peso molecular relativamente pequeno permanece no sobrenadante e é precipitado com etanol para obter ADN plasmídico bruto.
Método SDS alcalino
Ele desnatura seletivamente o DNA de fita dupla de hélice aberta no cromossomo dentro da faixa de pH de 12,0-12,5, enquanto deixa o DNA de fita dupla de circuito fechado inalterado. Após a neutralização com acetato de sódio, o SDS faz com que o complexo proteína-SDS e o DNA com alta massa molecular relativa precipitem, e então o DNA plasmídico é deixado no sobrenadante e separado por centrifugação em alta velocidade.
Purificação de DNA plasmidial
Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose alcalina
O DNA cromossômico de fita dupla de hélice aberta é facilmente desnaturado, enquanto o DNA plasmídico de fita dupla de círculo fechado não é facilmente desnaturado. No gradiente de concentração de sacarose, o DNA plasmídico se estabiliza mais rapidamente do que o DNA desnaturado e é separado e purificado.
Método de centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio-brometo de etídio (Et-Br)
O DNA de cadeia aberta da dupla hélice do cromossomo é fácil de combinar com o corante Et-Br e a densidade é reduzida. O DNA plasmidial não é adequado para ligação porque está firmemente fechado e a densidade é alta, por isso. é separado por centrifugação.
Método de adsorção por membrana de nitrocelulose
A membrana de nitrocelulose adsorve DNA de fita simples, e o DNA cromossômico é facilmente desnaturado para formar DNA de fita simples, que é separado do DNA plasmídico.
Transformar e construir
Exclua áreas não essenciais
Adicionar novos genes marcadores genéticos
Introduzir sequências de DNA com múltiplos locais de reconhecimento e clivagem de enzimas de restrição, ou seja, múltiplos locais de clonagem
fago lambda
Fago
Ele não pode se reproduzir independentemente das células hospedeiras e só pode crescer em células vivas e é estritamente específico das células hospedeiras.
Tipos principais
inserir vetor
vetor de substituição
Outras operadoras
recombinação genética
conceito
Gene e vetor alvo: combinação in vitro → recombinante.
Método de reorganização
Principalmente pontas pegajosas
ligação direta
Simples e eficiente
Adicionar ligação de cauda
Usando nucleotidil transferase terminal para criar extremidades adesivas nas extremidades do DNA
Enzima ferramenta principal: T4-DNA ligase (5'-P e 3'-OH)
recombinação de DNA
① Ligadura de extremidades adesivas produzidas pela mesma endonuclease
② Ligadura de pontas adesivas produzidas por enzimas homozigotas
③Conexão de diferentes extremidades adesivas
④Conexão de extremidades adesivas artificiais (extremidade saliente de 5', extremidade saliente de 3', extremidade plana)
⑤ Substituição da extremidade adesiva
Taxa de recombinação = índice de componentes pesados contendo DNA exógeno/número de moléculas de vetor, condições experimentais de rotina: 25~75%
Transformação e expressão genética
O gene alvo é introduzido nas células receptoras
célula hospedeira (célula receptora)
conceito
Células que recebem DNA de gene estranho durante transformação, transdução e hibridização
é local de amplificação recombinante
tipo
células procarióticas
Escherichia coli, Bacillus subtilis
células eucarióticas
Levedura (principalmente)
Características
Unicelular
Não patogênico, seguro
Competência
Competência
As células hospedeiras podem absorver moléculas de DNA exógenas e atuar efetivamente como receptores de transformação em certos estados fisiológicos.
dependendo
O estado fisiológico da própria célula receptora
Configuração e tamanho das moléculas de DNA recombinante
Células hospedeiras gerais em fase de crescimento logarítmico: capacidade de transformação Max
células competentes
Células em estado fisiológico que podem absorver moléculas externas de DNA.
Converter
Transformação induzida por Ca2 de células bacterianas intactas
transformação de eletroporação
Taxa de conversão
conceito
Fatores de influência
triagem de amplificação
amplificar
Método de triagem
Triagem baseada em genes vetoriais de resistência a antibióticos e medicamentos selecionados correspondentes
Método de triagem para transformação de Escherichia coli com vetor plasmídico portador de marcadores duplos de resistência a antibióticos
Portadora: Amp (resistente à ampicilina), Tet (resistente à tetraciclina)
Um gene estranho é inserido em um dos genes de resistência a antibióticos causando sua inativação
Duas placas de antibióticos para rastrear recombinantes
etapa
①Seleção positiva
Contém antibióticos correspondentes a genes de resistência inativados não inseridos
Transformante√
Transformante contendo plasmídeo contendo gene alvo √
Transformante contendo gene alvo recombinante √
Não transformante ×
②Seleção negativa
Antibióticos contendo genes de resistência inativados por inserção
Transformantes não recombinantes que não contêm o gene alvo√
Transformante contendo gene alvo recombinante ×
Comparação dos dois meios → Seleção: Transformantes contendo recombinantes do gene alvo
Triagem usando o gene lacZ do operon lactose (mancha azul-branca)
Bactérias com um operon lactose completo podem traduzir o gene LacZ que codifica β-galactosidase → hidrolisar X-gal → azul
Inserção de gene estranho → O gene LacZ não pode ser expresso → branco
Obrigatório: Nenhum gene inativado de resistência a antibióticos inserido → meio de cultura de ampicilina
Transformante contendo plasmídeo contendo gene alvo: cepa azul
Transformante contendo gene alvo recombinante: cepa branca
Aplicação de chip de DNA para identificação de recombinantes
Muitos oligonucleotídeos/fragmentos de DNA específicos (sondas) → fixo: posição predefinida do chip
Amostra a ser testada: rótulo → hibridizar com chip (princípio do emparelhamento de bases complementares) → detectar sinal de hibridização e análise computacional
Triagem baseada em produtos de tradução genética alvo (proteínas, enzimas, polipeptídeos) [Nenhum gene marcador ou não é possível sintetizar a sonda]
eletroforese em gel de proteínas
PÁGINA
Imunoensaio
ELISA
Western blotting
Imunoprecipitação
radioimunoensaio em fase sólida
Expressão do gene alvo
Aplicações na indústria alimentícia: alimentos geneticamente modificados
alimentos microbianos geneticamente modificados
definição
Bactérias de engenharia
Características
aplicativo
(1) Melhorar a qualidade dos produtos alimentares
(2) Simplifique o processo de produção e encurte o ciclo de produção
(3) Preservação antibacteriana e anti-séptica de alimentos
(4) Melhoria das bactérias produtoras de enzimas de qualidade alimentar
(5) Produção de ingredientes funcionais para alimentos saudáveis
(6) Detecção rápida de microrganismos alimentares
alimentos para animais geneticamente modificados
Tipos envolvidos
aplicação principal
Alterar a taxa de desova do gado;
Melhorar a composição nutricional dos produtos lácteos, especialmente para lactentes e crianças pequenas
Produção de proteínas séricas humanas, etc. através de biorreatores.
alimentos vegetais geneticamente modificados
definição
tipo
aplicativo
Melhorar a qualidade dos ingredientes alimentares
Melhorar os processos de produção de alimentos
Produção de aditivos alimentares e alimentos funcionais