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추출 공정의 반응 표면 최적화 및 분리대두 단백질 정제
분리대두단백의 추출 과정과 정제 반응 표면 최적화에 대한 마인드맵입니다. 주요 내용은 참고문헌, 재료 및 방법, 요약, 결론, 결과 및 분석, 서론(주제 선정의 목적과 의의)입니다. ).
編輯於2024-02-16 20:56:57
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추출 공정의 반응 표면 최적화 및 분리대두 단백질 정제
요약
머리말(주제의 목적과 의미)
재료 및 방법
재료, 시약 및 기기
재료
시중에서 판매되는 대두
기구
유형 752 분광광도계, 유형 UV-265 UV-가시광선 기록 분광계, 유형 PHS-3C 동결 건조기;
시약
β-메르캅토에탄올, 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250, 아크릴아미드, SDS
실험 방법/작업
샘플 준비
분리대두단백질 추출
알칼리 추출 및 산 침전
상온에서 대두박과 물을 1:15의 비율로 혼합하고 pH 8.0 환경에서 1시간 동안 교반하여 단백질을 용해시킨다. 이어서, 펄프 잔류물을 3000r/min에서 15분간 원심분리하여 분리하고 침전물을 버렸다. 상등액을 pH 4.5로 조정하고 30분 동안 방치하여 침전시킵니다(대두 단백질을 침전시키려면 알칼리성에서 산성 조건을 사용하십시오). 그런 다음 다시 25분간 원심분리하여 침전물을 수집하고 탈이온수로 3회 세척한 후 증류수 부피의 5배에 녹입니다. 최종적으로 용액의 pH를 7.5로 조정하고 3차 고속원심분리(30,000 r/min, 25 min)를 실시하여 상등액을 제거한 후 침전물이 처음 추출된 분리대두단백이었다.
단백질 추출율 계산(건조 샘플로 계산)
단백질 추출율 = 추출된 대두단백질 함량 / 대두 내 단백질 함량 × 100%
표준곡선의 확립
샘플 단백질 함량 측정
농도가 알려진 일련의 표준 단백질 용액을 준비하고 Coomassie Brilliant Blue 염료와 반응하여 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 그립니다. 테스트할 단백질 샘플을 적절한 농도로 처리하고 안정적인 조건에서 염료와 함께 배양합니다. 블랭크 컨트롤과 샘플을 포함하여 595nm 파장에서 각 튜브의 흡광도를 측정합니다. 얻은 흡광도 값을 사용하여 표준 곡선을 참조하여 시료의 단백질 농도를 계산합니다. 빛, 온도의 영향, 분석법에 대한 다양한 단백질 유형의 민감도 차이에 주의하면서 작동 중에 일정한 조건을 유지하십시오.
단일 요인 테스트
pH 8 침출
재료-액체 비율 1:14g/mL
추출온도 50℃
추출시간 60분
위의 조건을 바탕으로 반응표면 최적화 실험을 수행합니다.
반응 표면 테스트
세 가지 수준과 네 가지 요인
젤 여과
습식법으로 아가로스 겔을 준비하여 크로마토그래피 컬럼에 채우고 평형 처리를 위해 1mol/L NaCl PBS 완충액(완충액은 50mmol/L KH2PO4-Na2HPO4로 제조, pH 값은 7.6)을 사용합니다. 샘플은 PBS 완충액에서 준비되어야 합니다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 단백질 용액의 농도가 10mg/mL 미만인지 확인하십시오. 왜냐하면 이 농도가 높은 흡착 속도와 짧은 평형 시간을 달성할 수 있다는 것이 실험에서 반복적으로 입증되었기 때문입니다. 다음으로 시료를 컬럼에 올리고 선형 구배 용출을 위해 인산염 완충액을 사용하고 유속을 1.0mL/min으로 설정한 후 6mL마다 하나의 튜브를 수집하고 UV 검출기를 사용하여 280nm의 파장에서 검출합니다. 마지막으로 수집된 시료를 동결건조한 후 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다.
SDS-PAGE 감지
Kasran et al.[15]의 방법에 따라 겔 여과된 분리된 콩 단백질에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 분리 겔은 15%, 스태킹 겔은 5%를 차지하였다.
선택된 상대적 분자량 표준 단백질에는 포스포릴라제(97400 Da), 소 혈청 알부민(66200 Da), 토끼 액틴(43000 Da), 소 탄산 탈수효소(31000 Da), 트립신 억제제(20100 Da) 및 달걀 흰자 리소자임(14400 Da)이 포함됩니다. 다).
결과 및 분석
단일 요인 테스트 결과
추출 pH 8이 추출 속도에 미치는 영향
고액비 1:14g/mL가 추출속도에 미치는 영향
추출 온도 50℃가 추출 속도에 미치는 영향
60분의 추출 시간이 추출 속도에 미치는 영향
반응표면 최적화 실험
반응 표면 최적화 실험 설계 및 결과
표에서 볼 수 있듯이 모델 F 값은 5.65, P < 0입니다. 0024로, 모형이 유의미하고 적합도가 양호함을 나타냅니다. 적합도 부족 항목 P = 0.0737 > 0. 05로 나타나 모형은 유의미한 차이가 없고, 오차가 적으며, 적합도가 높은 것으로 나타났다. 또한 모형의 R2는 0.8682에 달해 반응값의 변동을 86.62% 설명할 수 있어 예측결과가 실제 결과와 매우 일치함을 알 수 있다. R2adj = 0.7145는 분리대두단백 추출 조건의 71.45%가 데이터 분석에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 분리대두단백의 추출에 대한 다양한 인자의 영향 정도는 A > C > D > B, 즉 추출 pH > 추출 온도 > 추출 시간 > 물질-액비이다. A와 C는 매우 유의한 영향을 미치고(P<0.01), D, A2, C2는 유의한 영향을 미치며(P<0.05), 그 외 항목은 유의미한 영향을 미치지 않습니다.
검증실험
반응표면 분석을 통해 최적의 추출 공정 조건은 추출 pH 9.00, 고액비 1:15g/mL, 추출 온도 57.00℃, 추출 시간 64.01min으로 얻어졌다. 실제 작업을 용이하게 하기 위해 최적 추출 공정 조건을 추출 pH 9, 고액비 1:15g/mL, 추출 온도 57°C, 추출 시간 64분으로 조정하였다. 이러한 조건으로 검증 실험을 진행한 결과, 평균 추출율은 4.75로 예측값에 가까운 것으로 나타났습니다. RSD 0.98%는 반응표면 테스트 결과가 신뢰성이 있음을 보여줍니다.
겔 여과 크로마토그램
SDS-PAGE 감지
결론적으로
대두박 분리대두단백질의 추출 공정 조건에 대해 단일 인자 실험 및 반응 표면 최적화 실험을 수행하였으며, 최적 공정 조건은 추출 pH 9, 고액비 1:15g/mL, 추출 온도 57°C, 추출시간 64분 최적 조건에서 분리대두단백의 추출율은 82.58%, 추출물 내 단백질 함량은 92.65%였다. 겔 크로마토그래피 후, 획득된 표적 단백질 스펙트럼은 단일 용출 피크를 나타냈고, 정제된 SPI의 총 단백질 함량은 98.56%에 도달했습니다. 그런 다음 SDS-PAGE를 통해 전기 영동 패턴에 혼합 밴드가 몇 개만 있음이 확인되었으며, 이는 단백질의 순도가 높고 후속 과학 연구 실험의 요구 사항을 충족할 수 있음을 나타냅니다.
참고자료
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[3] Lu Chen, Zou Yuhong, Zhang Shikang 등 반응 표면 방법론을 사용하여 차 잔류 단백질의 초음파 보조 추출을 위한 공정 조건 최적화 [J] Journal of Food and Biotechnology, 2012(3): 319-325 .
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팀원 : 아오 지안