MindMap Gallery 6微生物検査
これは、食品微生物学-6 微生物の量の決定、サンプルの収集と処理を含む微生物検査に関するマインド マップです。 生物分析およびその関連技術等
Edited at 2024-01-20 17:23:40食品中の微生物とその微生物 代謝産物の検出
微生物数の測定
標準プレート数 SPC
実験プロセス
サンプリング
希釈
10倍希釈
接種: 2 ~ 3 段階希釈、並行コントロール
注ぐ方法
塗装方法
熱に弱い細菌を検出
完全に好気性の細菌により適しています
コロニーの形態が明瞭で、集団の特徴が観察できます。
食べかすと混同しないでください
コロニーは重なって混合する傾向があります
栄養を与える
媒体、条件
逆さ培養: 培地の重量減少は 15% 未満
水滴の垂れを防ぐ
細菌の増殖を防ぐ
コロニー数
適切な細菌コロニー数、細菌の場合は 30 ~ 300 CFU、カビ/酵母の場合は 10 ~ 150 CFU のプレートを選択します。
方法:肉眼観察、コロニーカウンター
コロニーの特定: コロニーが小さすぎる、またはサンプル粒子に似ている - 色素還元法、TTC (赤色テトラゾリウム、発色媒体)、細菌の特性
計算する
レポート、有効数字 2 桁、ブランク コントロールのコロニー テスト結果は無効です
意義
微生物汚染の程度と衛生品質を判断する
食品の保存期間を予測する
鮮度を反映する
成長と繁殖のダイナミクスを監視する
生物由来製品の検査: 汚染、プロバイオティクス
その他の方法
水和乾燥膜法 - 培地
原理: プレハブ培地システム、再生可能な水和乾燥フィルム、培地、冷水可溶性ゲル、インジケーター、印刷グリッド
操作手順:希釈、接種、培養、計数、報告
アドバンテージ
高い生産性
小さな誤差
国際化: 公的機関からの承認
高速: 6 ~ 14 時間で 24 時間以内に正確な結果を推定できます。 カビと酵母の数を確認するのに 3 ~ 5 日
識別媒体
ローテーション接種法
接種軌道としてのアルキメデスの螺旋に従って、減少速度でサンプルに接種します。
自動スパイラル接種・計数システム
カウント方法: 中心部に多くのコロニーがあり、その周囲に少ないコロニーがあり、単位面積あたりのコロニーの数を計算します。
アドバンテージ
測定結果はSPCと高い相関を示します
欠点がある
最近傍番号の決定方法 MPN
検査対象の微生物の特別な生理機能を利用し、(干渉を減らすため)選択培地を使用して微生物の存在と存在量を判定します。
大腸菌群などの栄養および代謝特性を持つ微生物の検出
使いやすい
微生物群集の中で優勢ではない微生物も測定可能
大腸菌群
腸内細菌は糞便汚染と関係がある
特定の培養条件下で乳糖を発酵させて酸とガスを生成する、好気性および通性嫌気性の陰性非サッカロミセス属細菌。
一次発酵:LST、ガス生産者向け二次発酵BGLB
大腸菌を検出する意義
食品衛生品質を評価するための糞便汚染指標細菌
サルモネラ菌などの腸内病原菌による汚染の可能性を評価する(滋賀県)
指標菌としての利点
発生源が多く、大量、高い検出率
外部生存時間は基本的に同じです
殺菌剤に対する耐性は基本的に同じです
操作が簡単で複雑な機器は必要ありません
高感度
色素還元計数法(推定法)
原理: 生きた細胞には、特定の燃料をある色から別の色に還元できる還元酵素が含まれています。
一般的に使用される試薬
メチレンブルー
青から白へ
レザズリン
濃い青がピンク、白に変わります
テトラゾール
無色~赤色
還元時間は微生物濃度に反比例し、牛乳の衛生や精子の活動によく使用されます。
アドバンテージ
簡単、早くて経済的
欠点がある
微生物の還元能力はそれぞれ異なるため、還元酵素を含む食品には適しません。
直接顕微計数法 DMC
計数盤 直接計数
Petrovholzer 細胞計数チャンバー (一般細菌)、血球計数器 (酵母/カビ胞子)
一定容積内の微生物の数を数えますが、雑菌は区別できません
アドバンテージ
高速かつ便利な細胞形態解析、スライドの保存が簡単
欠点がある
細菌含有量が高く、精度が低く、疲労しやすいサンプルにのみ適しています。
その他の方法
綿棒塗抹法、サンプリング法
表面微生物の検出
食品、機器の表面、公共の場所に適用
膜ろ過法、サンプル濃度
細菌が非常に少ないサンプルでは細菌が濃縮され、検出率が向上します。
サンプル量による制限なし
検出方法:SPC、顕微鏡計数、染色法併用
物理的、化学的、分子的および免疫学的方法
物理
インピーダンス測定
インピーダンス
抵抗、インダクタンス、キャパシタンスを持つ生体材料において、電流の測定を妨げるインピーダンスをインピーダンスといいます。
原理: 微生物は培地の電気的特性を変化させ、電気的に不活性な基質は電気活性な分子とイオンに分解します。培地の導電率は増加し、インピーダンスは減少します。
経時的な導電率の変化
検出時間: 培養からインピーダンス値の突然の変化までの時間。元の細菌数に反比例します。
微生物の元の細菌数を推定
微生物は異なるインピーダンス曲線を持っています
微生物の同定
ダイレクトインピーダンス法
培養液を専用の測定管に入れ、微生物を接種した後、培養液に電極を挿入し、培養液の電気的特性の変化を直接測定します。
重要な要素、培地
テストされた細菌➕ 監視可能なインピーダンス変化が生じる
間接インピーダンス法
微生物の代謝活動では、微生物の代謝活動を反映して二酸化炭素などが生成されます。
二酸化炭素が試験管に入り、水酸化カリウムと反応して炭酸塩を生成します。これにより導電率が低下し、導電率の変化が記録されます。
アドバンテージ
培地の最適化が不要(電気を使わずに反応可能)
塩分濃度の高い培地も測定可能
酵母など、測定可能な導電率の変化をほとんどまたはまったく生じない測定可能な微生物
測定可能な食品自体がインピーダンス測定を妨げたり、電極を損傷したりする可能性があります。
微量熱量測定
化学薬品
ATPの測定
生きた細胞のエネルギー源、細胞死から2時間後に消失
細胞ATPは一定であり、その総量は細菌の数に比例し、計算できます。
指数関数的に増殖する原核生物細胞の ATP 含有量は、通常 2 ~ 6 nmol/mg 乾燥重量です。
同種の細胞内のATPを正確に測定
一般的な方法 ―ルシフェラーゼシステムによるATPの測定
ATPはルシフェリン-ルシフェラーゼ系に関与し、ルシフェリンを発光させ、発光量はATPに比例します。
発光強度に基づいて細胞数を計算
自動的に測定して迅速に検出できるため、結果は SPC 法と一致し、時間を節約できます。
応用
発酵ブロス中の細菌数の測定
尿サンプル検査
表面微生物検査
放射測定
原理: 細菌は炭水化物を代謝し、微量元素をグルコースまたは他の糖分子に標識し、放出された二酸化炭素を検出するときに二酸化炭素を生成します。
放射線量は細菌の数に比例する
検出時間は微生物の数に反比例します。
放射性エネルギーカウンター
応用
空気を吹き込んでお腹の異常をチェック
食品微生物検査
食品微生物のフィンガープリンティングと同定
フィンガープリント: 特徴的な化学成分、構造、性能の違い、特定の代謝物
特徴的なパターン: 識別可能、ユニーク
核酸認識
16srRNAの塩基配列
rRNAは全RNAの80%を占める
多くのセグメントは高度に保存されています
生物進化タイマー
系統地図
PCR
ポリメラーゼ連鎖反応、セルフリークローニング、細胞外で特定の DNA 断片を増幅する分子生物学的手法
病原性細菌の検出: 特定の断片、保存
原理: DNA ポリメラーゼの触媒作用の下、親鎖 DNA が鋳型として使用され、特定のプライマーが伸長の開始点として使用され、変性、アニーリング、伸長などのステップを通じて、娘の in vitro コピーのプロセスが行われます。鋳型DNAに相補的なDNA鎖を作製します。
反応成分
テンプレートDNA: 標的遺伝子 - 微生物に固有の遺伝子
プライマーペア:複製の開始点と終了点、複製の特異性
dNTP:A、T、G、C
DNAポリメラーゼ
反応緩衝液、マグネシウム塩溶液
アドバンテージ
特定の核酸断片の in vitro 増幅
高速、高感度、具体的
微生物自動分析システム
完全に自動化された微生物分析
原理:細菌の同定に必要な生化学反応用培地をカード上に固定し、培養後、表示される反応を数値解析により判定します。
グラム陰性菌カード、グラム陽性菌カード、酵母カード
API細菌同定システム
免疫学的方法
抗原 (Ag): 免疫系を誘導して免疫応答を生成し、生体内または試験管内で産生される抗体またはエフェクター細胞と特異的に反応する物質。
抗原決定基: 抗原表面の活性基
抗原性
抗原性: 免疫原性と反応原性
不均一性:タンパク質、糖、核酸(化学組成)、5~10区の免疫効果の低下(分子量)
抗体 (Ab): 抗原が体内に侵入したときに B 細胞によって合成および分泌される、抗原と特異的に反応できる活性物質の一種。主に血清中に存在します。
抗原および抗体の検出方法: 細菌または毒素の検出
凝集反応
既知の抗体が抗原を識別する
顆粒状の抗原は対応する抗体に結合し、誘電体の存在下で一定時間が経過すると、肉眼で小さな凝集片が現れます。
沈殿反応
中和反応
標識抗体または抗原技術
サルモネラ菌 1-2 実験
原理: 2 つの特別な容器で実行されます。1 つは選択的な液体培地を含み、もう 1 つは非選択的な半固体培地を含みます。
抗原と抗体が結合して、肉眼で見える免疫バンドを形成します
酵素免疫吸着法 ELISA
粒子抗原: 細菌、ウイルスなど。
可溶性抗原: エンテロトキシン、マイコトキシンなど。
定性的または定量的
シンプルで素早い操作
実験原理
酵素は抗体または抗原に結合します
抗原と抗体間の特異的反応
酵素触媒による基質の発色、肉眼または機器による定性または定量分析
特異性 ➕ 酵素シグナルの増幅
必要な材料
支持を固める
酵素標識された抗原または抗体
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、良好な安定性
アルカリホスファターゼ
酵素作用の基質
O-フェニレンジアミン(黄色)
テトラメチルベンジジン(青)
タイプ
直接法、間接法、サンドイッチELISA:粒子抗原の測定
競合法:マイコトキシンなどの小分子抗原の測定
サンドイッチELISA(サンドイッチELISA)
①コーティング:抗体1 ②洗浄:余分な試薬や結合の弱い試薬を除去します。 ③検査対象のサンプルを追加します。 ④洗浄; ⑤酵素標識抗体2を添加します。 ⑥洗濯。 ⑦基質を追加します。 ⑧ 停止反応
アドバンテージ
複数のサンプルを同時に検出でき、自動化でき、操作が簡単で、商品化できます。
金コロイドクロマトグラフィー
原理
リムルス (hou) 試薬アッセイ
陰性細菌の細胞壁内のエンドトキシンを高感度に測定する方法
原理: カブトガニに溶解したエンドトキシンと溶解物との反応により、定性的または半定量的にゲルが形成されます。
生物分析および関連技術
実験動物の選択
検査物質に対する感受性、性別、年齢、体重
被験物質の投与方法
食事、飲料水
経口投与、カプセル
注射:腹腔内、皮下
手術
ボツリヌス毒素検査
動物実験における外科的処置
結紮リング技術
サンプルの収集と処理
従うべきサンプリング原則
サンプリング計画を決定します: 耳レベル 2、レベル 3
代表性: 無作為に実施され、すべての食品を代表する
汚染を防ぐ無菌操作
元の状態を維持: 揮発、温度
ジャストインタイム: サンプリングして検査に送る
サンプリング計画
タイプ
サンプリング
n: 製品の同じバッチについて収集する必要があるサンプルの数
結果判定
c:m値を超える最大許容サンプル値
m: 微生物指標の許容レベルの限界値
M微生物学的指標の最大安全限界値
レベル2
レベル 3
食品の危険性
カテゴリー I の危険性、高齢者、乳児、幼児向けの食品、および摂取前に危険性を高める可能性のある食品
カテゴリー II の危険性、すぐに食べる食品、危険性は摂取前に基本的に変化しない
カテゴリー III の危険性、危険性を軽減するために摂取前に加熱された食品
食品に対する検査指標の重要性: 一般、中、重度