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Toxicologie 4 Bases de l'expérience de toxicologie
Cette image présente les principes et les limites des expériences toxicologiques, l'objectif fondamental des expériences toxicologiques, la sélection et la gestion des animaux de laboratoire, les méthodes expérimentales sur les animaux, l'analyse statistique des résultats expérimentaux toxicologiques et le contrôle qualité des expériences toxicologiques. utile à tout le monde, aidez-moi!
編輯於2024-02-18 11:49:24
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Toxicologie 4 Bases de l'expérience de toxicologie
Questions de révision après les cours
1. Quelles sont les raisons de l’incertitude liée à l’extrapolation des résultats expérimentaux sur les animaux aux humains ?
2. Quels principes de base doivent être suivis dans la conception des expériences toxicologiques ?
3. Quelles questions faut-il prendre en compte pour déterminer si les résultats expérimentaux ont une signification biologique ?
Quels sont les types et les objectifs des expériences de toxicologie ?
Expériences in vitro
Dépister, prédire la toxicité, explorer les mécanismes
Expériences in vivo
Évaluation de la toxicité : animaux → humains
recherche démographique
Vérification des résultats des expérimentations animales
1. Principes et limites des expériences de toxicologie
1. Principes de base des expériences de toxicologie
1. Les effets sur les animaux de laboratoire peuvent être extrapolés aux humains
①L'espèce animale la plus sensible est l'homme.
②Les processus biologiques et le métabolisme chimique des humains et des animaux de laboratoire sont liés au poids corporel ou à la surface corporelle.
Les deux hypothèses ci-dessus constituent la prémisse de toute biologie expérimentale et de toute médecine.
2. Les animaux expérimentaux doivent être exposés à des doses élevées
Selon la définition de la réponse qualitative, l'incidence des effets de groupe augmente avec l'augmentation des niveaux d'exposition.
Configurez 3 groupes de doses ou plus et observez la relation dose-réponse.
Plus la distance entre la LOAEL et la dose d'exposition humaine est grande, plus elle est sûre.
3. Les sujets expérimentaux sont des animaux adultes en bonne santé.
Les animaux adultes en bonne santé servent de modèles expérimentaux représentatifs pour la population générale, rendant les résultats expérimentaux représentatifs et reproductibles.
4. La voie d’empoisonnement est la voie d’exposition possible pour les humains.
2. Limites des expériences de toxicologie
L’extrapolation des expérimentations animales aux humains est incertaine
Il existe une incertitude quant à l’extrapolation de doses élevées à des doses faibles.
L’extrapolation d’un petit nombre d’animaux à un grand nombre de personnes est incertaine
Des animaux adultes en bonne santé sont généralement utilisés et la réaction est relativement simple.
3. Principes « 3R » et éthique de l’expérimentation animale
Principe des « 3R »
remplacement
Méthode scientifique qui utilise des expériences ou d'autres recherches menées par d'autres méthodes que les animaux pour atteindre un objectif expérimental, ou qui utilise du matériel expérimental non sensible au lieu d'animaux vertébrés conscients pour les expériences.
réduction
Méthode permettant d'obtenir la même quantité de données expérimentales avec moins d'animaux ou d'obtenir plus de données expérimentales avec un certain nombre d'animaux.
Raffinement
Méthodes qui améliorent et perfectionnent les procédures expérimentales pour soulager ou réduire la douleur et l’inconfort des animaux et assurer leur bien-être.
Problèmes éthiques dans l’expérimentation animale
loi
"Loi Martin", "Règlement sur l'administration des animaux de laboratoire"
respecter les principes
Assurer une gestion et un traitement sans cruauté des animaux de laboratoire ; minimiser la douleur et l'inconfort des animaux de laboratoire ; éviter l'utilisation inutile d'animaux de laboratoire ;
Principes éthiques de l'expérimentation humaine
principe du consentement éclairé
Principe du bénéfice sans préjudice
principe de finalité médicale
principe scientifique
principe de contrôle expérimental
2. Objectifs fondamentaux des expériences de toxicologie
L’objectif fondamental de l’évaluation de la sécurité
Observer les effets toxiques et les propriétés de la substance testée
Études sur les relations dose-réponse (effet)
Déterminer les organes cibles de la toxicité
Déterminer la réversibilité des dommages
Autres objectifs des expériences de toxicologie
Indicateurs de détection sensibles des effets toxiques
marqueurs biologiques
mécanisme d'empoisonnement
Toxicocinétique des substances d'essai
Métabolisme de la substance d'essai et mesures de secours en cas d'empoisonnement
3. Sélection et gestion des animaux de laboratoire
animal de laboratoire
Les animaux élevés artificiellement et les micro-organismes qu'ils transportent sont contrôlés, avec un bagage génétique clair et une origine claire. Il est principalement utilisé pour la recherche scientifique, l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des médicaments et des produits biologiques, ainsi que pour l’enseignement.
Sélection d'espèces animales expérimentales
Choisissez généralement deux espèces : les rongeurs et les non-rongeurs
Le principe de base
① Les caractéristiques métaboliques, biochimiques et toxicologiques sont similaires à celles des humains
②Durée de vie naturelle plus courte
③Facile à gérer et à utiliser
④Économique et facile à obtenir
Sélection de souches animales expérimentales
Souche : Terme propre en zoologie expérimentale, qui fait référence à un groupe d'animaux du même ancêtre obtenu par des méthodes d'accouplement planifiées, ou à des animaux, des plantes ou des micro-organismes provenant du même ancêtre et possédant un génotype spécifique.
Animaux expérimentaux classés par contrôle génétique
inné
Une pure souche d'animal élevée par accouplement continu entre frères et sœurs ou parents et enfants depuis plus de vingt générations. Par exemple, les souris ont BALB/C, Jinbai I, Jinbai II, etc.
Animaux du groupe hybride (croisement 1 génération, F1)
La première génération d'animaux résultant de l'accouplement délibéré de deux souches consanguines différentes. Il existe une héritabilité claire et une vigueur hybride.
groupe fermé
Une population est un groupe d'animaux qui n'introduit pas de sang neuf de l'extérieur pendant plus de 5 ans, et n'est qu'un groupe d'animaux de la même souche qui sont accouplés et reproduits au hasard dans un lieu fixe. Comme les souris Kunming, les souris NIH, les rats Wistar, etc. Le plus utilisé dans la recherche en toxicologie.
Paramètres de contrôle microbiologique pour les animaux de laboratoire
Animal conventionnel (CVA)
Animal propre (CLA)
Dans les tests de toxicité et les études toxicologiques, des animaux CLA ou supérieurs doivent être utilisés pour garantir la fiabilité des résultats expérimentaux.
Animal Spécifique Sans Agent Pathogène (SPF)
Animal sans germes (GFA)
Normes de qualité microbienne pour les animaux de laboratoire
Niveau I : CVA, système ouvert, pas de maladies transmissibles à l'homme.
Niveau II : CLA, système barrière, en plus des normes de niveau I, la limite d'espèce est claire, et il n'y a pas de maladies infectieuses spécifiques à l'animal.
Niveau III : SPF, barrière ou système d'isolement, en plus des normes de niveau II, élevés selon les exigences de la lignée pure, élevés dans un isolateur ou une salle à flux laminaire, peuvent avoir des colonies bactériennes non pathogènes et aucun agent pathogène pathogène.
Niveau IV : GFA, système d'isolement, animaux purs élevés dans des conditions stériles complètement fermées, sans aucun micro-organisme ni parasite (dont la plupart des virus) en dehors des animaux.
Sélection individuelle d'animaux de laboratoire
genre
âge et poids
État physiologique
État de santé
Structure de l'animalerie de laboratoire
Zone d'accueil et de quarantaine des animaux
Zone d'alimentation animale et d'expérimentation
Aire de stockage des aliments, de la litière et des fournitures
Zone de lavage et de désinfection
Zone de stockage et de traitement des déchets
zone de gestion
Types d'animaleries expérimentales
système ouvert : environnement ordinaire
Système barrière : Propreté classe 10 000
Système d'isolation : propreté niveau 100
4. Méthodes d'expérimentation animale
Principes de conception d'expérimentation animale
principe de randomisation
Entièrement randomisé (conception à un seul facteur)
Randomisation stratifiée (conception d'appariement)
Principe de contraste
Contrôles communs pour les tests toxicologiques
Contrôle non traité (contrôle blanc)
Aucun facteur de transformation, aucune substance d'essai, aucune opération
Déterminer la valeur de fond des caractéristiques biologiques, contrôle qualité
Contrôle négatif (contrôle du solvant)
Il n'y a pas de facteurs de traitement, les facteurs expérimentaux nécessaires (solvants) sont donnés et l'influence des facteurs expérimentaux (solvants) est éliminée.
contrôle positif
Utilisez des positifs connus pour tester l’efficacité du système expérimental.
Les tests de toxicologie génétique, les tests de tératogénicité et les tests de cancérogénicité ont tous des groupes témoins positifs.
maîtrise de soi
Les mêmes sujets de recherche ont été comparés avant et après le traitement. Par exemple, observez les changements de tension artérielle avant et après la prise du médicament.
Il est nécessaire que les conditions expérimentales avant et après le traitement par les facteurs de recherche soient cohérentes et que les paramètres observés soient stables.
Comparaison historique
Il se compose de données de groupe témoin provenant de plusieurs expériences passées dans le même laboratoire.
Vérifiez la stabilité du système expérimental grâce à des tests d’homogénéité pour contrôler et garantir la qualité du laboratoire.
Principe de répétition
Répétez toute l’expérience
Assurer la reproductibilité des résultats expérimentaux.
Observations répétées de plusieurs sujets
Il doit y avoir une taille d'échantillon suffisante pour chaque groupe.
Points clés de la conception des expériences sur les animaux
Regroupement de doses pour les tests de toxicologie in vivo
Nombre d'animaux dans chaque groupe
Période de test
Préparation avant les expérimentations animales
Après avoir acheté des animaux de laboratoire, les mâles et les femelles doivent être conservés séparément.
Généralement, la quarantaine dure 5 à 7 jours.
Identification du sexe des animaux de laboratoire couramment utilisés
Préparation avant exposition au poison
Regroupement d'animaux
Pesée, numérotation, regroupement aléatoire
Préparation de la substance d'essai
Groupe de doses, volume d'exposition, dilution
Choix de la voie d'exposition
Tractus gastro-intestinal, voies respiratoires, peau, sous-cutané, intradermique, musculaire, cavité abdominale, veine
Préparation de la substance d'essai
Préparations empoisonnées
Formes posologiques courantes : solution aqueuse, suspension, solution huileuse
Les substances d'essai solubles dans l'eau restent cohérentes avec la pression osmotique dans le corps
Substance d'essai insoluble dans l'eau, dissoute ou en suspension dans un solvant organique approprié
La substance d’essai doit généralement être préparée fraîche avant utilisation.
Points clés dans la préparation des préparations empoisonnées
Lors de la préparation, ne chauffez pas l'objet à tester à une température qui modifierait ses propriétés physiques et chimiques.
Pour évaluer la toxicité cutanée des substances d'essai solides, leur forme et leur taille de particules doivent être conservées.
Préparer la substance d'essai à plusieurs composants selon la formule afin que la préparation reflète fidèlement le mélange d'origine
Les préparations doivent conserver leur stabilité chimique et leur cohérence avec la substance d'essai.
La préparation doit réduire le volume total du test et ne pas utiliser trop de solvant ou d'excipient.
Les préparatifs doivent être faciles à préparer pour l’exposition
Le pH de la préparation est préférable entre 5 et 9
Ne pas utiliser d'acides ou de bases pour dissocier la substance d'essai
En cas d'intoxication parentérale, la solution finale doit être la plus isotonique possible.
Voies d'exposition des animaux de laboratoire
Exposition orale (gastro-intestinale)
Avaler des gélules
alimentation
Administration par voie orale
Infection par les voies respiratoires
Recherche sur les poisons chimiques existant sous forme de gaz, vapeur, poussière, fumée, brouillard, etc. dans les conditions de production et évaluation des polluants atmosphériques environnementaux
Exposition par inhalation : statique et dynamique
Injection intratrachéale : réalisée après anesthésie
exposition cutanée
Poisons chimiques à l’état liquide, gazeux ou même poussière
La plupart d'entre eux choisissent des lapins et des cobayes. La peau des deux côtés de la colonne vertébrale de l'animal est épilée, le poison chimique est appliqué localement, puis recouvert et fixé avec une cloche en verre, du papier huilé ou un film plastique pendant une certaine période. temps.
Pesticides, cosmétiques, polluants environnementaux, médicaments topiques
Rats couramment utilisés
Modes d'exposition
Épilation : épilation chimique ou mécanique
Exposition au poison : application locale ou méthode de trempage de la queue
Exposition par injection
injection intrapéritonéale
injection intraveineuse
injection intramusculaire
injection sous-cutanée
Collecte d'échantillons biologiques
Collecte d'urine et de selles
Collecte d'échantillons d'organes
Collecte de bile
collecte de sang
fin
Collecte de sang non terminale
Le volume de prélèvement sanguin unique représente moins de 15 % du volume sanguin total de l’animal et n’affectera pas l’animal.
Les effets secondaires se produiront lorsque le volume sanguin représente 15 à 20 % du volume sanguin total.
Les prélèvements sanguins multiples toutes les 24 heures ne doivent pas dépasser 1 % du volume sanguin total.
anesthésie
Anesthésie générale (pentobarbital de sodium) et locale (procaïne, etc.)
euthanasie
Processus consistant à tuer des animaux en utilisant des méthodes humaines et publiquement reconnues afin qu'ils meurent paisiblement et sans douleur, sans peur ni anxiété.
Anatomie pathologique et collecte d'échantillons
L'examen pathologique constitue une partie importante des tests toxicologiques, et les études pathologiques peuvent aider à déterminer les effets nocifs et les organes cibles. L'examen pathologique comprend l'anatomie globale et l'examen histopathologique.
anatomie globale
Moins d’une demi-heure après le sacrifice des animaux expérimentaux, ils ont été disséqués en utilisant la méthode d’extraction combinée des organes thoraciques et abdominaux.
Observez la forme, l’état de la surface, la couleur, la bordure, la taille, la texture et la section des organes concernés.
Pesez les organes désignés et calculez les coefficients des organes.
Modes opératoires normalisés pour l'anatomie pathologique des animaux de laboratoire
1. Fixez l'animal sur la planche à dissection et disséquez le cou (glande parotide, ganglions lymphatiques, etc.)
2. Prenez un côté de la peau de la poitrine et de la taille, ouvrez l'abdomen et élargissez l'incision (organes abdominaux internes).
3. Thoracotomie (organes internes de la poitrine, langue et gorge, trachée, glande thyroïde, etc.)
4. Décollez le membre postérieur gauche (muscles, etc.), le cuir chevelu et les oreilles, ouvrez le crâne et exposez la moelle épinière.
Examen histopathologique
Utilisez un couteau bien aiguisé pour couper l’organe ou le tissu désigné et unifier les parties.
Les blocs de tissus sont généralement fixés dans 10 fois le volume d'une solution de formaldéhyde à 10 %, puis systématiquement préparés (inclusion de tissu en paraffine, coupe et coloration HE).
Observer et enregistrer au microscope pour poser un diagnostic pathologique.
5. Analyse statistique des résultats des expériences de toxicologie
Analyse statistique des résultats
Comparaison par paires entre chaque groupe de traitement et le groupe témoin négatif et comparaison entre plusieurs groupes de traitement et le groupe témoin négatif
relation dose-réponse et relation dose-réponse
tableau de contrôle qualité
Questions auxquelles il faut répondre lors de l'évaluation des résultats des tests toxicologiques
Est-ce statistiquement significatif ?
Est-ce biologiquement significatif ?
S'il a une signification toxicologique, c'est-à-dire s'il a des effets nocifs
Questions à considérer pour déterminer l’importance biologique
Comparaison longitudinale : s'il existe une relation dose-réponse pour les modifications de ce paramètre.
Comparaison horizontale : si les modifications de ce paramètre s'accompagnent de modifications d'autres indicateurs connexes.
La différence entre les moyennes du groupe de traitement et du groupe témoin est plus de deux fois supérieure à l’erreur de détection.
Questions à considérer pour déterminer l’importance biologique
Comparaison avec les contrôles historiques : La valeur normale de référence des animaux de laboratoire est composée des résultats du contrôle négatif d'au moins 10 expériences indépendantes récemment menées dans ce laboratoire en utilisant la même souche d'animaux de laboratoire et le même solvant, et sa moyenne ± 1,96 × standard. L'erreur est utilisée comme plage de valeurs de référence. Les contrôles négatifs doivent se situer dans une erreur standard de ± 3 × la moyenne des contrôles historiques.
Si une certaine valeur observée dans le groupe de traitement est comparée à celle du groupe témoin, la différence est statistiquement significative et si elle remplit l'une des conditions suivantes, elle peut être considérée comme ayant dépassé la plage de valeurs de référence normale et constitue un effet nocif.
①La valeur dépasse la plage de valeurs de référence normale
②La valeur se situe dans la plage de valeurs de référence normale, mais la différence persiste pendant un certain temps après l'arrêt du contact.
③La valeur se situe dans la plage de valeurs de référence normale, mais si le corps est dans un état de stress fonctionnel ou biochimique, la différence sera plus évidente.
Signification statistique et signification biologique des résultats des tests toxicologiques
6. Contrôle qualité des expériences de toxicologie
Bonnes pratiques de laboratoire (BPL)
Il s'agit d'un règlement de gestion formulé pour l'évaluation de la toxicité des médicaments, additifs alimentaires, pesticides, cosmétiques et autres articles médicaux.
Il s'agit d'un document réglementaire qui réglemente un système de gestion organisationnelle complet pour la recherche sur la sécurité non clinique liée à la santé humaine et à l'environnement, y compris la planification expérimentale, la mise en œuvre, la supervision, les enregistrements et la gestion des dossiers.
L'histoire du développement du BPL au pays et à l'étranger
Les pays développés ont commencé à développer et à mettre en œuvre officiellement les BPL dans les années 1960 et 1970.
Les pays qui ont mis en œuvre des systèmes BPL sont les États-Unis, le Japon, le Royaume-Uni, l'Allemagne, les Pays-Bas, la Suède et la Suisse.
À la fin des années 1980, la Chine a mené successivement des travaux de recherche et de mise en œuvre des BPL sur les médicaments et autres produits et poisons connexes.
Objectif et signification
Destiné à organiser et gérer les activités de recherche du personnel scientifique et technologique
Encourager les chercheurs à améliorer la qualité et la validité des données expérimentales
Promouvoir la reconnaissance mutuelle des données expérimentales à l’échelle internationale
Évitez la duplication inutile des expériences et réduisez le gaspillage de ressources
Assurer la fiabilité, l’intégrité et la répétabilité des résultats expérimentaux
Contenu fondamental
Exigences pour les organisations et le personnel
Exigences relatives aux installations, instruments, équipements et matériels expérimentaux expérimentaux
Procédures opérationnelles standard (SOP)
Exigences pour le processus de mise en œuvre des travaux de recherche
Exigences relatives aux archives et à leur gestion
Certification, supervision et inspection des qualifications des laboratoires
Procédures opérationnelles standard SOP
L’objectif est d’assurer la reproductibilité opérationnelle et la crédibilité des résultats.
Lorsque le personnel ayant reçu une éducation et une formation effectue des tests conformément aux SOP, la reproductibilité de leurs opérations de test et de leurs résultats est meilleure.
Dans le même institut de recherche ou laboratoire, si différentes personnes effectuent des opérations et des tests conformément aux SOP, cela peut garantir des résultats plus cohérents.
système organisationnel
Unité d'assurance qualité (QAU—Unité d'assurance qualité)
QAU fait référence au département ou à l'organisation au sein de l'agence d'inspection chargé de garantir que son travail est conforme aux spécifications BPL.
QAU est la clé de la construction BPL. Avoir un bon plan expérimental et des SOP pour diverses opérations spécifiques ne garantit pas nécessairement des résultats de test de haute qualité.
Chef de projet (SD-Directeur d'Etude)
Désigne la personne chargée d'organiser et de mettre en œuvre un certain travail de recherche ou d'inspection. Le SD est la figure centrale de la gestion organisationnelle spécifique de l'agence de contrôle. Posséder une structure de connaissances étendue et une riche expérience de travail. La culture et la qualité du SD sont cruciales pour les laboratoires BPL.
Contrôle qualité de la conception expérimentale en toxicologie
Points clés dans la conception d'expériences de toxicologie in vivo
Regroupement de doses pour les tests de toxicologie in vivo
Nombre d'animaux dans chaque groupe
Période de test
Conception de tests de toxicologie in vitro
Tester la solubilité de la substance d'essai
Recommandation de la dose la plus élevée à tester (10 mmol/L ou 5 mg/ml)
Activation métabolique (homogénat de foie de rat adulte mâle prétraité au PCB 1254, 90 000 g de surnageant centrifuge (S9) et système de régénération du NADPH)
Contrôle qualité lors de la mise en œuvre des expériences de toxicologie
Procédures opérationnelles et gestion du laboratoire
Gestion des réactifs
Gestion des instruments
gestion de l'environnement
Gestion des animaux de laboratoire
Gestion aveugle
tableau de contrôle qualité
Contrôle qualité de l'analyse des résultats des expériences toxicologiques
Analyse statistique des données expérimentales
Évaluation des résultats expérimentaux
Questions de réflexion
Étant donné que les tests de toxicité chronique ont un cycle long, consomment beaucoup d'animaux et nécessitent beaucoup de main-d'œuvre et de ressources matérielles, comment garantir la fiabilité des tests chroniques sur les animaux ?
Le contrôle qualité en laboratoire est une condition préalable pour garantir le succès du test ainsi que la scientificité et l’exactitude des données expérimentales.
Les tests de toxicité chronique doivent être gérés conformément aux bonnes pratiques de laboratoire (BPL).
Y compris une conception expérimentale raisonnable, la sélection et la gestion des animaux, la préparation et la gestion des substances d'essai, l'opération expérimentale et le contrôle des conditions d'essai.