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MindMap Gallery Biologie – Kapitel 2 Enzyme als Werkzeuge für die Gentechnik-Mindmap
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Biologie – Kapitel 2 Enzyme als Werkzeuge für die Gentechnik-Mindmap
Dies ist eine Mindmap über die Werkzeugenzyme der Gentechnik in Kapitel 2 der Biologie. Das Design des Gentechnikkurses bezieht die Eigenschaften und Eigenschaften von Werkzeugenzymen mit ein.
Edited at 2023-11-16 23:39:36
Biologie – Kapitel 2 Enzyme als Werkzeuge für die Gentechnik-Mindmap
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Kapitel 2 Werkzeugenzyme für die Gentechnik
Restriktionsendonuklease
Funktion: Erkennen spezifischer Sequenzen in doppelsträngigen DNA-Molekülen und Schneiden der doppelsträngigen DNA (kommt hauptsächlich in prokaryotischen Bakterien vor und hilft Bakterien, die Invasion fremder DNA zu begrenzen).
Restriktionsmodifikationssystem (Abwehrsystem von Bakterien)
Einschränkung: Dies bedeutet, dass bestimmte Arten von Bakterien eindringende Fremd-DNA durch die Wirkung von Restriktionsendonukleasen zerstören können, wodurch die Invasion biologischer Zellen durch Fremd-DNA begrenzt wird.
Modifikation: Die eigenen DNA-Moleküle der biologischen Zelle werden durch die Wirkung von Methylase an bestimmten Basenpositionen methyliert, was sie vor Schäden durch ihre eigenen Restriktionsendonukleasen schützen kann.
Restriktionsendonuklease vom Typ II
Grundfunktionen
Erkennen Sie spezifische Sequenzen von 4–8 Basenpaaren in doppelsträngigen DNA-Molekülen
Die Schnittstellen der meisten Enzyme liegen innerhalb oder auf beiden Seiten der Erkennungssequenz
Identifizieren Sie die Spaltungssequenz als klassische rotationssymmetrische Palindromstruktur
Spaltt DNA, um Enden zu erzeugen, die 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen enthalten
Versetzte Schnitte erzeugen klebrige Enden, Schnitte entlang der Symmetrieachse erzeugen flache Enden
Ablauf einer enzymatischen Reaktion
Die meisten Typ-II-Enzyme erfordern ähnliche Reaktionsbedingungen
Kombinierte enzymatische Multi-Enzym-Hydrolyse
Prinzipiell können Enzyme, die die gleiche Salzkonzentration benötigen, gleichzeitig verdaut werden, allerdings dürfen sich die Enzymschnittstellen nicht überlappen.
Enzyme mit unterschiedlichen Anforderungen an die Salzkonzentration
Nutzen Sie die für teurere Enzyme erforderliche Salzkonzentration, erhöhen Sie die Dosierung billigerer Enzyme und hydrolysieren Sie gleichzeitig enzymatisch
Das Enzym mit niedrigem Salzgehalt schneidet es zuerst, fügt dann Salz hinzu und das Enzym mit hohem Salzgehalt schneidet es erneut.
Ein Enzym schneidet zuerst, dann wird der Puffer gewechselt und ein anderes Enzym schneidet erneut
Faktoren, die die Enzymaktivität beeinflussen
1||| Reinheit der DNA-Probe
Verunreinigungen: Protein, Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, SDS, NaC usw.
Ansatz
Erhöhen Sie die Enzymmenge: 10 U Enzym für 1 μg DNA
Gesamtreaktionsvolumen erhöhen
Reaktionszeit verlängern
2||| Methylierungsgrad von DNA-Proben: Die Methylierung spezifischer Nukleotide in der Erkennungssequenz schränkt die Aktivität des Enzyms stark ein.
3||| DNA-Molekülstruktur
Bestimmte Restriktionsendonukleasen erfordern ein Vielfaches an Enzymen, um superspiralisierte Plasmid-DNA oder virale DNA zu spalten, als um lineare DNA zu verdauen.
Einige Nukleinsäure-Restriktionsendonukleasen schneiden Restriktionsenzymstellen an unterschiedlichen Positionen und auch ihre Effizienz ist deutlich unterschiedlich.
4||| Puffereigenschaften von Endonukleasen: Hohe Konzentrationen an Enzymen, hohe Konzentrationen an Glycerin, niedrige Ionenstärke, extreme pH-Werte usw. führen zu einer geringen Spezifität in den Erkennungs- und Spaltungssequenzen einiger Endonukleasen, d. h. zum Phänomen der Sternaktivität.
5||| Temperatur der Verdauungsreaktion: Die Standardreaktionstemperatur für die meisten Restriktionsendonukleasen beträgt 37 °C
Beendigung der Restriktionsenzymreaktion
Die meisten Enzyme: 65°C warmes Bad für 5 Minuten
Einige thermostabile Enzyme (wie BamH Ⅰ und Hae Ⅱ): Geben Sie die Lösung für die Terminationsreaktion hinzu (geben Sie 0,5 mol/L EDTA hinzu, damit die Endkonzentration in der Lösung 10 mmol/L erreicht, um Mg2 zu chelatisieren).
Anwendung
Schneidet DNA an bestimmten Stellen, um spezifische Restriktionsenzymfragmente zu produzieren
Durch die Spaltung mit Restriktionsenzymen entstehen identische klebrige Enden für die Rekombination
Erstellen Sie eine Restriktionskarte der DNA
Erstellen Sie eine Genbibliothek
Southern Blot
Schritte zum DNA-Verdau (Verdau von 0,2–1,0 μg DNA)
Fügen Sie das entsprechende Volumen DNA-Lösung hinzu
Fügen Sie 2 μl des entsprechenden 10-fachen Restriktionsenzym-Verdauungspuffers hinzu und mischen Sie
1-2 U Restriktionsenzym hinzufügen und mischen
Stellen Sie die oben genannten gemischten Reaktanten auf die entsprechende Temperatur und inkubieren Sie sie für die erforderliche Zeit
0,5 mol/L hinzufügen
DNA-Polymerase
charakteristisch
Escherichia coli DNA-Polymerase I (DNA pol I)
aktiv
5'->3' DNA-Polymeraseaktivität
5'->3'-Exonukleaseaktivität
3'->5'-Exonukleaseaktivität
Grundlegende Verwendung
Nick-Übersetzung: Die 5'->3'-Exonuklease- und Polymerase-Aktivitäten arbeiten zusammen, um den Nick voranzutreiben.
Herstellung von 32P-markierten DNA-Sonden
Escherichia coli DNA-Polymerase I großes Fragment (Klenow-Enzym)
Grundeigenschaften
Quelle: Escherichia coli DNA-Polymerase Ⅰ wird mit Subtilisin behandelt, um das N-terminale Drittel des großen Peptidsegments, das Klenow-Enzym, zu erhalten
Hat 5'->3'-DNA-Polymeraseaktivität Hat 3'->5'-Exonukleaseaktivität Verlust der 5'->3'-Exonukleaseaktivität
Grundlegende Verwendung
1||| Füllen Sie die durch Endonukleasen erzeugten 5'-klebrigen Enden aus
2||| Isotopenendmarkierung von DNA-Fragmenten
3||| Synthese des zweiten cDNA-Strangs
4||| Bestimmung der DNA-Sequenz durch Didesoxy-Kettenendterminierungsmethode
T4-DNA-Polymerase
Grundfunktionen
① 5'->3'-DNA-Polymeraseaktivität ② 3'->5' exonukleolytische Polymeraseaktivität ③ Fehlende 5'->3'-Exonukleaseaktivität ④ In Abwesenheit von dNTP kann die Exo-Spaltung von jedem 3'-OH-Ende aus durchgeführt werden ⑤ Wenn nur eine Art von dNTP vorhanden ist, stoppt die Exolyse, wenn das komplementäre Nukleotid freigelegt wird. ⑥ Wenn alle vier dNTPs vorhanden sind, dominiert die Polymerisationsaktivität
Grundlegende Verwendung
①Schneiden Sie das durch Endonuklease erzeugte 3'-klebende Ende ab
② Isotopenendmarkierung von DNA-Fragmenten
T7-Bakteriophagen-DNA-Polymerase
Grundfunktionen
① 5'->3'-DNA-Polymeraseaktivität ② 3'->5'-Exonukleaseaktivität ③ Hat die stärkste Prozessivität unter den bekannten DNA-Polymerasen ④ Nach der Modifikation wird es mithilfe der Didesoxy-Kettenabbruchmethode zu einem Sequenzierungsenzym für lange DNA-Fragmente.
Grundlegende Verwendung
Primerverlängerungsreaktionen für längere DNA-Fragmente
Schnelle Endmarkierung durch Auffüll- oder Austauschreaktionen (Verdrängungsreaktionen).
Terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT)
Grundfunktionen
Quelle: Kalbsthymus
Templatfreie DNA-Polymerase baut dTNP zufällig am 3'-OH-Ende ein
Grundlegende Verwendung
Fügen Sie komplementäre Homopolymerschwänze zur Vektor- oder Ziel-DNA hinzu
Isotopenmarkierung von 3'-Enden von DNA-Fragmenten
RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase)
Grundfunktionen
(1) cDNA-Synthese gesteuert durch RNA
(2) Bidirektionale Exzision des RNA-Strangs im DNA-RNA-Hybridstrang (RNase H-Aktivität)
(3) DNA-gesteuerte DNA-Polymerisationsaktivität
Häufig verwendete Reverse Transkriptase
AMV: ein Reverse-Transkriptase-Enzym, das aus gereinigtem Vogel-Myeloblastom-Virus gewonnen wird (funktioniert bei 42 °C)
MMLV: Ein Expressionsprodukt des Reverse-Transkriptase-Gens des Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV) in E. coli (funktioniert bei 37 °C)
Grundlegende Verwendung
Transkribieren Sie die RNA eukaryontischer Gene in DNA und erstellen Sie eine cDNA-Bibliothek
Bewerten und markieren Sie das 3'-Ende von DNA-Fragmenten mit 5'-Überhängen und bereiten Sie Sonden vor
Ersetzt das Klenow-Fragment für die DNA-Sequenzierung
Thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Enzym)
Thermische Stabilität
Ionenabhängigkeit
Schlechte Wiedergabetreue: Besitzt 5'->3'-Polymerase-Aktivität und 5'->3'-Exonuklease-Aktivität; Es gibt jedoch keine 3'->5'-Korrekturaktivität und am Ende des synthetisierten Berechnungsfragments wird ein zusätzliches Adenylat A hinzugefügt.
Nukleinsäure-modifizierendes Enzym
T4-Polynukleotidkinase (T4-PNK)
Eigenschaften: Katalysiert die Übertragung der γ-Phosphatgruppe von ATP auf das 5'-OH-Ende von DNA oder RNA
Zweck: Wird zur Isotopenmarkierung von Sondenenden verwendet
Alkalische Phosphomonoesterase: Entfernt 5'-Phosphatgruppen aus DNA und RNA
Funktion: Katalysiert die Entfernung der 5'-Phosphatgruppe aus Nukleinsäuremolekülen und wandelt dadurch das 5'-P-Ende des DNA- oder RNA-Fragments in das 5'-OH-Ende um. Seine Rolle beim molekularen Klonen besteht darin, die Selbstligation zwischen diesen zu verhindern Klebrige Enden.
Grundlegende Verwendung
Entfernen Sie die Phosphatgruppe am 5'-Ende der Vektor-DNA, um zu verhindern, dass der Vektor sich selbst zyklisiert, und um die Rekombinationsrate zu verbessern
Entfernen Sie 5'-Phosphatgruppen aus DNA und RNA und markieren Sie sie dann mit T4-Polynukleotidkinase
Alkalische Phosphomonoesterase (CIP) aus Kalbsthymus: inaktiviert bei 68 °C
Basische Phosphatmonoesterbindung (BAP) von E. coli: stabil bei 68 °C und resistent gegen Phenolextraktion
Einzelsträngige Exonuklease: Exonuklease VII (ExoVII)
doppelsträngige Exonuklease
Exonuklease III (ExoIII)
Lambda-Exonuklease (λExo)
Einzelsträngige Endonuklease: S1-Nuklease
Grundlegende Eigenschaften: Von Aspergillus oryzae ① Die Erklärung einzelsträngiger DNA ist 75.000-mal schneller als die Erklärung doppelsträngiger DNA ② Erforderliches Zn2 ③ Optimaler oH-Bereich: 4,0–4,3 ④ Erfordert NaCl: 10~300 mmol/L
Grundreaktion
① Endocution einzelsträngiger DNA oder RNA
② Doppelsträngige DNA oder RNA mit Kerben oder Spalten darin
wichtige Verwendungszwecke
① Entfernen Sie den einzelsträngigen Überhang des DNA-Fragments und machen Sie daraus ein stumpfes Ende ② Entfernen Sie die Haarnadelstruktur, die während der cDNA-Synthese entstanden ist ③ Analysieren Sie die Menge an mRNA durch das S1-Nuklease-Schutzexperiment ④ Durch die Hybridisierung reifer mRNA und genomischer DNA in Kombination mit der Hydrolyse durch dieses Enzym können Introns lokalisiert werden ⑤ Schneiden Sie die Enden progressiver Deletionsmutationen ab
Einzelsträngige endo-doppelsträngige Exonuklease: Bal31-Nuklease
Grundfunktionen
DNA-Ligase
Häufig verwendete Enzyme
Escherichia coli-DNA-Ligase: Verwendung von NAD+ [Nicotinamidadenindinukleotid] als Cofaktor
T4-Bakteriophage T4-Ligase: verwendet ATP [Adenosintriphosphat] als Cofaktor
Gleicher Wirkmechanismus
Grundeigenschaften
Reparieren Sie Phosphodiesterbindungen an Lücken in doppelsträngiger DNA
Repariert die Phosphodiesterbindung an der Lücke im DNA-Strang, der an den RNA-Strang gebunden ist
Verbinden Sie doppelsträngige DNA-Moleküle mit stumpfen Enden
Reaktionsbedingungen
Klebrige Endverbindungen
Flache Endverbindung
Direkte Ligation mit T4-DNA-Ligase
Mitbewohner plus Schwanzanschluss
Mit Steckverbindern verbinden
DNA-Adapter-Ligation